钆贝葡胺合成中间体BOPTA有关物质的制备及结构鉴定

方钦虎 沈伟艺 曾德云 郭鹏飞

摘 要：目的：对合成钆贝葡胺的中间体BOPTA工艺中所含的未知杂质进行了分离纯化和结构鉴定。方法：基于制备液相色谱，优化色谱分离参数，通过两步分离纯化，制备BOPTA及其2个未知杂质。借助质谱和核磁技术对杂质结构进行结构表征。结果：2个未知杂质结构鉴定为 2，2-（1，9-dicarboxy-12-phenyl-11-oxa-2，5，8-triazadodecane-5，8-diyl）diacetic acid（杂质1）、4-carboxy-8-（carboxymethyl）-1-phenyl-2-oxa-5，8，11-triazatridecan-13-oic acid（杂质2）。结论：本研究为药物及医药合成中间体杂质的分离纯化和结构鉴定提供借鉴。

关键词：钆贝葡胺；BOPTA；制备液相色谱；分离纯化；杂质

中图分类号：TQ421.3+6 文献标识码：A 文章编号：1671-2064（2019）11-0195-02

0 引言

钆贝葡胺的合成工艺是以BOPTA（4-羧基-5，8，11-三（羧甲基-1-苯基-2-氧杂-5，8，11-三氮杂十三烷-13-酸））为原料，与三氧化二钆发生络合反应得到钆贝酸，再投入葡甲胺络合得到[1]。BOPTA是钆贝葡胺合成的关键中间体，在其质量控制方面起着重要作用。杂质产生机理，杂质结构确证和杂质限量控制已经成为药品质量的重要研究内容[2]。对于杂质的研究，目前常利用现代仪器设备和各种分析表征手段对杂质进行富集、纯化制备和结构鉴定。目前对于BOPTA生产工艺中产生的杂质仍没有被报道。高效液相色谱法（HPLC）是目前制药领域广泛使用的分离分析技术[3-6]。HPLC采用粒度均匀的小颗粒填料和自动化仪器，具有高柱效、重复稳定和在线监测等优点。施猛等人使用HPLC对于钆贝葡胺注射液中葡甲胺的含量进行了研究[7]。本文基于制备液相色谱技术，通过两步制备方法，获得BOPTA和2个相关杂质，并对杂质进行了纯度分析、质谱和核磁的结构表征。

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

磷酸二氢钾（纯度≥99.0%）购于上海泰坦科技股份有限公司；制备级乙腈购于上海星可高纯溶剂有限公司；HPLC级磷酸、乙腈购自中国百灵威公司；实验用水由Milli-Q纯化系统（美国Millipore公司）制备；BOPTA粗品由浙江司太立制药股份有限公司车间合成。

BOPTA样品分析及方法优化采用Waters Alliance e2695高效液相色谱仪，包括四元梯度泵、自动进样器、2489 UV/Visible检测器、在线脱气机、柱温箱和EmpowerTM 3.0色谱工作站（美国Waters公司）；分离纯化采用Waters纯化系统包括2545二元梯度泵、2489 UV/Visible检测器、2767馏分收集模块和Masslynx 4.1操作软件；高分辨质谱采用Agilent HPLC1260-QTof 6520液质联用仪；核磁表征在Bruker AVANCE III-600 MHz超导核磁共振波谱仪完成。分析柱Unitary C18和XAqua（250mm×4.6mm，5μm）、制备柱Unitary C18和XAqua C18（250mm×20mm，10μm）购于浙江华谱新创科技有限公司。

1.2 纯化制备

BOPTA样品加水溶解，浓度为300mg/mL。在制备柱XAqua C18（250mm×20mm，10μm）上进行初次分离。采用20mM磷酸二氢钾（pH=3.0）（A）-乙腈（B）为流动相，梯度洗脱0-30min，7-18%B，流速20mL/min，进样体积1mL，检测波长215nm。经初次制备共获得3个馏分，记为Fr 1～Fr 3。

馏分Fr1～Fr3经浓缩后，在Unitary C18制备柱上进行二次纯化。以20 mM 磷酸二氢钾（pH=3.0）（A）-乙腈（B）为流动相等度洗脱。馏分经浓缩、脱盐、冻干处理，共获得Fr 1-1（impurity 1，54.8mg），Fr 2-1（impurity 2，64.7mg），Fr 3-1（BOPTA，800.5 mg），。通过纯度分析、高分辨质谱、1H-NMR和13C-NMR表征确定化合物的结构（图1）。

2 结果与讨论

在4.6mm内径的分析柱上进行条件优化后，在20mm的制备柱上开展放大制备实验。初次制备条件见1.2节，制备图如图2（A）所示，获得馏分Fr.1～Fr.3。尽管一次洗脱液中杂质成分纯度较低，但组分较为简单，便于二次制备高纯度杂质。馏分采用低温旋蒸脱去有机溶剂，再进行第二次纯化。由于成分相对简单，实验采用了等度洗脱条件和连续进样方式，提高了制备效率。以馏分Fr 2为例，单针运行时间为20min，而采用连续进样方式，进样间隔分别为13min。单位时间内（100min），制备效率提高了1.6倍。图2（B）为连续制备图，图中红色箭头表示进样时间点。通过二次分离纯化，从BOPTA样品中制备获得BOPTA和2个相关物质。

3 结构表征

制备所得化合物经过纯度分析、质谱、1H-NMR和13C-NMR进行结构表征。纯度分析结果：杂质1（99.1%）、杂质2（98.2%）和BOPTA（99.2%）。

雜质1：白色粉末，UV λmax 205nm，ESI-MS m/z： 454.1899 [M-H]-，结合1H-和13C-NMR谱数据推测分子式为C20H29N3O9，1H-NMR（600MHz，D2O）δ：7.45（5H，m， H16-20），4.61（6H，m，H5-7）.13C-NMR（150MHz，D2O）δ：169.9（C-1），169.2（C-2），163.9（C-3），167.6（C-4），53.9（C-5），59.7（C-6），60.4（C-7），65.7（C-8），65.1（C-9），73.3（C-10），41.0（C-11），55.2（C-12），51.7（C-13），42.2（C-14），136.8 （C-15），128.7（C-16），128.9（C-17），128.6（C-18），128.9（C-19），128.7（C-20）.鉴定该化合物为2，2-（1，9-dicarboxy-12-phenyl-11-oxa-2，5，8-triazadodecane-5，8-diyl）diacetic acid。

杂质2：白色粉末，UV λmax 205nm，ESI-MSm/z： 396.1892 [M-H]-，结合1H-和13C-NMR谱数据推测分子式为C18H27N3O7，1H-NMR（600MHz，D2O）δ：7.40（5H，m，H14-18），4.39（1H，s，H-6）.13C-NMR（150MHz，D2O）δ：169.4（C-1），169.2（C-2），166.0（C-2），47.9（C-4），55.3（C-5），66.2（C-6），66.7（C-7），73.26（C-8），43.1（C-9），53.4（C-10），55.7（C-11），42.9（C-12），136.7（C-13），128.5（C-14），128.8（C-15），128.5（C-16），128.8（C-17），128.5（C1-8）.鉴定该化合物为4-carboxy-8-（carboxymethyl）-1-phenyl-2-oxa-5，8，11-triazatridecan-13-oic acid。

BOPTA：白色粉末，UV λmax 205nm，ESI-MS m/z： 512.1903[M-H]-，结合1H-和13C-NMR谱数据推测分子式为C22H31N3O11，1H-NMR（600MHz，D2O）δ：7.36（5H，m，H18-22），4.12（1H，s，H10），3.41-3.18（8H，m，H13-16）.13C -NMR（150MHz，D2O）δ：170.5（C-1），170.5（C-2），172.5（C-3），171.1（C-4），172.1（C-5），56.1（C-6），56.1（C-7），54.3（C-8），53.9（C-9），66.6（C-10），66.0（C-11），73.2（C-12），51.6（C-13），50.8（C-14），51.2（C-15），50.0（C-16），136.9（C-17），128.5（C-18），128.8（C-19），128.4（C-20），128.8（C-21），128.5（C-22）。鑒定该化合物为BOPTA。

4 结语

在药物合成反应过程中不可避免地会产生杂质，故研究合成产物的杂质，有利于了解合成过程与方法的合理性，以期对工艺进行评估和改进，从而对于药物的安全性提供保障。本实验基于制备液相色谱法，以BOPTA粗品为原料，优化色谱分离纯化参数，并放大到制备水平，采用两步纯化方法制备了BOPTA和2个相关杂质，为其质量控制奠定基础。

参考文献

[1] 施猛，任亚东，刘恩桂，张国文.钆贝葡胺的合成[J].广东化工，2016，43（16）：66.

[2] 王康林，孙月婷，皮士卿，曾苏.维生素E中间体三甲基氢醌合成工艺中有关物质的制备及结构鉴定[J].药物分析杂志，2017，37（08）：1363-1369.

[3] Petruczynik A， Wróblewski K， et al.， Determination of some psychotropic drugs in serum and saliva samples by HPLC-DAD and HPLC MS [J]. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis，2016，127：68-80.

[4] Gedawy A， Al-Salami H.， et al.， Development and validation of a new analytical HPLC method for simultaneous determination of the antidiabetic drugs， metformin and gliclazide [J]. Journal of food and drug analysis，2019，27：315-322.

[5] Yamini Y， Safari M， et al.， Simultaneous determination of steroid drugs in the ointment via magnetic solid phase extraction followed by HPLC-UV [J]. Journal of Pharmaceutical Analysis，2018，8：250-257.

[6] Luo ZQ， Liu AX， et al.， Development of a stability indicating HPLC method for simultaneous determination of ten related substances in vonoprazan fumarate drug substance [J]. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis，2018，149：133-142.

[7] 施猛，任亚东，孙秋艳，刘志强.高效液相色谱法测定钆贝葡胺注射液中葡甲胺含量的研究[J].广东化工，2016，43（22）：204-205+207.