番茄种子消毒方法探究

刘昊,杨雨晴,邵一飞,高伟,陈永臣,姚宇峰



番茄种子消毒方法探究

刘昊1,杨雨晴1,邵一飞1,高伟2*,陈永臣1,姚宇峰2*

1. 北京林业大学生物科学与技术学院, 北京 100083 2. 北京林业大学理学院, 北京 100083

番茄种子表面常常带有病原微生物，故在培养番茄无菌苗时，需要进行消毒。传统番茄种子的消毒剂是氯化汞，而其较大的毒性和消毒原理限制其在实验室及实际生产上的应用。因此，本研究开发出一套新的采用无毒或低毒试剂的消毒方法来制备番茄无菌苗，从而消除重金属离子对蛋白质的变性作用，并排除杂菌污染，进而为探究蛋白类物质对番茄的促生作用做前期实验方法的研究铺垫。对氯化汞、次氯酸钠和过氧化氢三种消毒剂采用正交实验，选取各自合适的浓度和时间梯度联合洗衣粉和75%乙醇消毒效果进行最佳消毒条件的摸索。结果表明，20%次氯酸钠消毒5 min以及8%次氯酸钠消毒+1%吐温20消毒1 min的消毒效果较好，但吐温20对幼苗的苗重有一定的抑制作用。运用单因素实验设计对正交实验结果进行验证和进一步摸索消毒条件，结果表明，次氯酸钠消毒对种子萌发率影响不大，次氯酸钠浓度在10%~40%的差异不显著，故最佳的消毒方式为10%次氯酸钠消毒5 min。通过蛋白质溶液进行消毒条件的验证，最终表明，建立的番茄种子消毒方法可以用于研究活性物质对番茄的生理作用，且消毒效果较好。

种子消毒; 番茄

番茄（）作为一种模式植物，被用于研究植物生理、发育、遗传等多项领域。番茄种子表面常常带有病原微生物，被认为是许多作物病害发生的初侵染源[1,2]，所以在培养番茄无菌苗时，需要先进行消毒。在传统番茄种子消毒的方法中，常使用氯化汞。然而氯化汞处理后种子萌发时间晚，且硝酸银和氯化汞处理会导致番茄苗的向地性消失[3]。氯化汞较大的毒性和其消毒原理限制了其在实验室及实际生产中的应用。从文献角度来看，次氯酸钠、过氧化氢和乙醇等是常用的消毒剂。然而次氯酸钠灭菌时间长，效果不够理想，但是从萌发率和污染率综合考虑认为3～4%次氯酸钠的效果较好[4,5,6]。由于番茄种子表面有微绒毛，不易消毒彻底。可以采用加入吐温20的方法提高效果，此外，在培养过程中，还可以采用添加蔗糖、无机盐等方法促进壮苗的形成[7]。

本研究采用三因子三水平正交实验设计，减小工作量，增大探索范围，对氯化汞、次氯酸钠和过氧化氢三种消毒剂进行条件摸索。采纳文献报道的最佳条件作为中间水平，氯化汞处理作为阳性对照，灭菌水处理作为阴性对照；且一并探索最佳的氯化汞处理条件。

本研究旨在探索一套采用无毒或低毒试剂的化学消毒方法并适用于番茄种子消毒的实验方法，既消除重金属离子对蛋白质的变性作用，也可排除杂菌对番茄的作用，并为探究蛋白类物质对番茄的促生作用做前期实验方法的研究铺垫[2]。

1 材料与方法

1.1 材料

市面购买的佳红5号番茄种子；挑选无霉变的种子，并随机分组。

1.2 实验方法与设计

1.2.1 实验方法

1.2.1.1 番茄种子培养方法培养介质选用滤纸或1.3%的琼脂溶液；在自然湿度下，28 ℃全光照培养。通过照度计（型号TA8131，产自中国苏州特安斯电子有限公司）测量光照情况，光强范围为365~665 Lux，接受光照距离251 mm~324 mm。

1.2.1.2 番茄种子消毒方法称取0.7~0.8 g番茄种子（通常0.7~0.8 g质量的佳红5号番茄种子约为25粒），置于2 mL离心管中，加入1 mL洗衣粉溶液，震荡约10次，用移液器吸出液体，更换枪头注入1 mL灭菌蒸馏水，震荡充分，用移液器吸出液体，重复4~5次；再加入1 mL 75%乙醇，消毒30 s，用移液器吸出液体，更换枪头，加入1 mL灭菌蒸馏水，如上述冲洗4~5次；加入消毒剂处理，如需加入吐温20，则优先加入吐温20溶液；再用灭菌水冲洗4~5次；最后统一加入1 mL灭菌水，离心管置于50 ℃水浴锅浸种15 min。流程见图1。

图1 种子消毒流程图

1.2.2 测定指标每日监测污染率、萌发率两项指标，并在萌发率稳定三天后测定苗总重，其中污染的种子可能萌发也可能未萌发。各指标计算方法如下：污染率（%）=污染数（个）/接种数（个）*100%；萌发率（%）=萌发数（个）/接种数（个）*100%。

1.2.3 实验设计

1.2.3.1 不同介质对番茄种子萌发的影响将0.6~0.7 g种子（约25~30粒）接种于滤纸或1.3%琼脂培养基上，每种处理进行两组重复，每天记录萌发率及污染率，萌发率稳定3 d后对茎长和根长做测量并记录，并实时记录培养过程中的定性情况。用灭菌水浸种作为对照，水面稍没过种子即可。

1.2.3.2 不同消毒剂、消毒剂浓度、消毒时间及吐温20含量对番茄种子消毒效果的影响采用三因子三水平正交实验设计，各组水平依消毒剂种类不同而定。每种处理接种约10粒，重复3次。每天统计各组萌发率，3 d后，对总萌发质量做测量并记录。对照1为用灭菌水代替消毒剂，其余处理同其他实验组，对照2为所有处理均改用灭菌水。三种消毒剂的正交实验因子水平表如表1。

1.2.3.3 验证实验采用单因素随机区组实验设计，对正交实验所得的最优消毒组合进行实施，并对其中一个因素进行三水平梯度单因素实验，并与空白对照组进行比较，检验该最佳配比的可靠性。

1.2.3.4 番茄种子表面观察利用体视显微镜观察并拍照干燥的蒸馏水和吐温20溶液震荡前与蒸馏水和吐温20溶液震荡后的对比状态下番茄种子的表面情况。以解释吐温20溶液对消毒过程的影响。

1.2.3.5 实例验证实验将本实验室分离纯化得到的一种能够促进植物根系生长的蛋白质处理最佳方法消毒的番茄种子，观察其消毒效果及消毒是否对蛋白质的功能有所影响。

表 1 三种消毒剂的正交实验因子水平表L9(34)

备注：阴性对照1：采用灭菌水代替消毒剂，其余与实验组处理一致；阴性对照2：完全灭菌水处理。

Note: Negative control 1: using sterile water instead of disinfectants and the rest is the same as experimental group; Negative control 2: completely sterile water treatment

1.3 数据处理方法

应用DPS v7.05版数据处理系统进行实验设计、数据处理。多重比较方法均采用LSD法，种子萌发率、污染率均采用反正弦平方根数据转换处理。应用matlab 7.1进行作图。

2 结果与分析

2.1 培养介质对种子萌发效果的影响

从图2和图3可以看出，培养介质有利于番茄种子的萌发和污染率的降低。从表2来看，滤纸和琼脂两介质的不同对番茄种子萌发的影响不显著；同时对番茄种子萌发后的茎长影响不显著而对根长影响显著，琼脂更利于幼苗的根发育。此外，琼脂作为介质有透明性好，柔软易于根测量等优点。因此，使用琼脂作为介质进行后续实验更为恰当。

图2 培养介质对种子萌发率的影响

图3 培养介质对种子污染率的影响

表2 培养介质对种子的影响情况

备注：大写字母表示1%极显著水平，小写字母表示5%显著水平。

Note:The capital letter indicates the 1% extreme level, the small letter indicates the 5% significant level.

2.2 不同消毒剂、消毒剂浓度、消毒时间及吐温20含量对番茄种子消毒效果的影响

从两个对照组来看，采用洗衣粉和酒精处理对番茄种子的消毒效果有极显著的提高。对照组1和对照组2的萌发率分别为77%和73%，污染率为37%和63%。且污染导致幼苗整体生长不佳。从表3幼苗质量的方差分析来看，洗衣粉和酒精处理能够极显著地提高番茄种子萌发后的幼苗质量。

从表4表5表6可见，氯化汞组的最佳组合为0.05%氯化汞+1%吐温20消毒2 min；次氯酸钠组的最佳组合为20%次氯酸钠消毒5 min以及8%次氯酸钠消毒+1%吐温20消毒1 min；过氧化氢组的最佳组合为2%或者10%过氧化氢+1%吐温20消毒10 min。从污染率而言，次氯酸钠组和氯化汞组均无污染现象，从幼苗质量而言，次氯酸钠组的整体效果优于氯化汞组和过氧化氢组，故采用次氯酸钠组的结果进行验证。此外，吐温20对三种消毒剂的消毒效果均有促进作用，但与次氯酸钠联合使用时，会降低幼苗的质量，故在验证时，采用20%次氯酸钠消毒5 min。

表 3 对照组方差分析与字母表示法

表4 氯化汞组正交实验结果

表5 次氯酸钠组正交实验结果

2.3 正交实验验证

从表7可见，用次氯酸钠消毒和用灭菌水消毒对消毒结果的影响极显著。次氯酸钠消毒剂浓度对番茄种子的消毒效果影响不显著。这与正交结果略有差异，但由于差异并不显著，采用10%~40%次氯酸钠均可。

表6 过氧化氢组正交实验结果

表7 验证实验多重比较

2.4 番茄种子表面观察

A为干燥条件下的番茄表面：可以看见番茄种子的表面遍布绒毛，这些绒毛会成为附着细菌和真菌的地点，且容易在液体消毒的过程中产生大量气泡，阻碍了消毒剂与表面接触，从而阻碍消毒剂作用于番茄表面。

B和C为滴加吐温20与蒸馏水后的番茄表面情况：可以看见加入吐温20的情况和加入蒸馏水的情况并无太大差异，显微镜下吐温20的番茄表面气泡略少于蒸馏水。

D和E为模拟消毒过程（离心管震荡20 s）后的番茄表面情况：与滴加时的情况相近。

图 4 种子消毒过程的观察

2.5 实验结果验证

根据表8的实验结果可知该蛋白对番茄的根长的作用呈低促高抑，方差分析表明抑制、促进作用差异极显著。说明该方法对蛋白质促进番茄种子根长的作用不会有影响，可以用于研究蛋白质对番茄种子的作用。

表8 蛋白质功能实验的多重比较

3 讨 论

三种消毒剂在消毒过程中表现不同，但各有优劣。氯化汞的优点为消毒快、彻底、作用广泛，用量少，物质稳定，保质期长；缺点是毒性大，对种子损伤大，不易处理，有剧毒，管制。次氯酸钠的优点是消毒快、彻底、作用广泛，毒性低；缺点是物质不稳定，有效物质浓度会降低、有机物会降低消毒效果、有一定的腐蚀性。过氧化氢的优点是无污染；缺点是消毒需要浓度高、有腐蚀性[5-9]。

由于氯化汞的消毒机理,故在研究外源性物质对幼苗的作用时,不能采用氯化汞做消毒剂。Mickai等首次报道分别采用0.05%氯化汞、5%或1%硫酸、0.5%磺胺乙汞三种消毒剂消毒番茄对幼苗无伤害作用，但本文中的实验现象否定了该结论，并与魏丽丽等的氯化汞消毒后会使幼苗丧失向地性的结果一致。在实验过程中，次氯酸钠和过氧化氢均对种皮有褪色作用[3,10]，这与吴华等的实验现象一致[11]。种皮在褪色透明后，清晰可见番茄种皮内部的子叶与胚的形态，但并不影响其萌发率。过氧化氢的氧化性能够促使种皮腐蚀，使胚根容易伸出，在本研究中，过氧化氢组的萌发速度在各消毒剂组中是最快的，侧面印证胡重怡等的实验结论[12]。也说明过氧化氢作为消毒剂具有良好的开发潜力，有待进一步探索其条件。近年国外并无对番茄种子消毒的研究，但国外对种子的消毒更多采用次氯酸盐，表明实验室中采用次氯酸盐消毒效果较好，可能是一种趋势。结果也与之相符[13-15]。

吐温20是一种非离子型表面活性剂，它使消毒剂与材料能够充分接触。番茄种子表面有大量的绒毛，在加入表面活性剂之后能够加强消毒效果[7,16]。董飞等在研究大葱无菌苗的培养消毒条件时，加入了吐温20能够明显提高大葱种子的萌发势、萌发率，降低其污染率[16]；这与本文的探究结果相一致，但本研究中还发现加入吐温20会降低番茄幼苗的苗重。

利用无菌苗进行后续实验，可以避免微生物的影响：在研究一些物质对植物的作用或植物对某物质的吸收时，需要避免微生物对该物质的分解或避免微生物的代谢物质对植物的作用。或者在研究微生物与植物的相互作用时，需要避免其他微生物对该体系的影响，故需要无菌苗的制备[2]。

4 结 论

在本研究的探索范围内，最佳的消毒方式为20%次氯酸钠消毒5 min不加吐温20。整体的消毒步骤为：洗衣粉清洗→灭菌水冲洗4~5次→75%乙醇消毒30 s→灭菌水冲洗4~5次→8%次氯酸钠+5 min→灭菌水冲洗4~5次→50 ℃灭菌水浸种15 min。吐温20对消毒剂的消毒效果有增强作用。

通过验证实验发现，次氯酸钠的浓度对消毒效果没有显著性影响，但使用次氯酸钠消毒和不使用差异极显著。同时，本研究中发现，吐温20有一定的增加消毒剂消毒效果的功效，但对番茄幼苗的生长有一定的抑制作用，而对萌发率没有抑制作用。

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Exploration for the Disinfectant Method of Tomato Seed

LIU Hao1, YANG Yu-qing1, SHAO Yi-fei1, GAO Wei2*, CHEN Yong-chen1, YAO Yu-feng2*

1.100083,2.100083,

There are pathogenic microorganisms on the surface of tomato seeds, so it is necessary to sterilize for cultivating the aseptic seedlings of tomato. The traditional disinfectant for tomato seed is mercuric chloride, but its toxicity and sterilization principle limit the application in the laboratory and practical production. Therefore, this study developed a set of new sterilization method by using non-toxic or low-toxic disinfectants in order to eliminate the denaturation effect of heavy metal ions on proteins and exclude the microbial contamination, thus preparing for the exploration of growth-promoting effect of protein on tomato. We used the orthogonal experiment, selected the suitable concentration and time gradient of three kinds of disinfectants, mercuric chloride, sodium hypochlorite and hydrogen peroxide and explored the best sterilization conditions with the combination of washing powder and 75% alcohol. Results show that 20% sodium hypochlorite sterilization 5 minutes or 8% sodium hypochlorite and 1% Tween20 sterilization 1 minutes is better, but Tween20 has certain inhibition to the weight of seedlings. Using the single factor experimental design to verify the results of orthogonal experiment and further explore the sterilization conditions, the results show that the sodium hypochlorite sterilization has little effects on seed germination rate and the concentration of sodium hypochlorite in 10% ~ 40% has no significant difference. So the best way of sterilization is 10% sodium hypochlorite sterilization 5 minutes. The verification of sterilization conditions by using protein solution finally indicates that this established tomato seed sterilization method can be used to study the physiological function of active substances to tomato and the sterilization effect is better.

Seed sterilization; tomato

S641.2

A

1000-2324(2019)03-0393-06

10.3969/j.issn.1000-2324.2019.03.008

2018-01-08

2018-03-07

中央高校基本科研业务费专项资金资助(2018ZY18);北京林业大学创新创业训练项目(X201710022144)

刘昊(1996-),男,本科生,专业方向:微生物与植物相互关系. E-mail:liuhao1996@bjfu.edu.cn

Author for correspondence.E-mail: w_gao@bjfu.edu.cn;yaoyufeng@126.com