党参无菌苗培养前种子消毒技术研究

薛雯心 魏铁锁 袁金月 刘立业 姜雪琪 李秀霞

摘要[目的]研究不同消毒方法下党参种子的消毒效果。[方法]以党参种子为试验材料，通过10%H2O2、0.1%HgCl2和2%NaClO这3种消毒剂，75%乙醇预处理，无菌水预浸泡，对党参种子的消毒效果进行比较。[结果]在10%H2O2、0.1%HgCl2和2%NaClO这3种消毒剂中，2%NaClO浸种20 min的消毒效果最好；用75%乙醇预处理20 s可降低种子带菌率；在党参种子消毒之前，无菌水预浸泡24 h可提高發芽率。[结论]该研究结果为培育党参无菌苗等研究提供了重要依据。

关键词党参；种子消毒；无菌苗

中图分类号S567.5+3文献标识码

A文章编号0517-6611（2017）12-0130-02

Abstract[Objective]To study the disinfection effects of Codonopsis pilosula seedling under different disinfection treatments.[Method]Taking C.pilosula seeds as test materials，through three kinds of disinfectants 10%H2O2， 0.1% HgCl2 and 2% NaClO，pretreatment with 75% ethanol and presoaking with sterile water，the effects of

C.pilosula seed sterilization were studied.[Result]2%NaClO had the greatest sterilization effect.The germcarring rate of seed was decreased with pretreatment of 75% ethanol.The seeds were soaked in aseptic water for 24 hours before sterilization，the seeds germination rate could increase.[Conclusion]The results of this study provide an important basis for the research on the cultivation of sterile seedlings of C.pilosula.

Key wordsCodonopsis pilosula；Seed disinfection；Aseptic seedling

党参[Codonopsis pilosula（Franch.） Nannf.]为桔梗科多年生藤本植物，分布于甘肃、山西、四川、云南和黑龙江等地，其性味甘平、无毒，有活血化淤、补中益气、生津止渴等功效，主治脾肺虚弱、内热消渴、食少便溏、气短心悸、虚喘咳嗽等症[1]，为我国传统的补益药，临床上可单独使用，也可以与其他中药配合使用。近年来，在党参治疗冠心病、高血脂症、低血压病和功能性子宫出血等病症方面取得了新的进展，并将党参用于保健食品的研制与开发，使其用量速增[2]。

党参的市场需求量很大，传统的遗传育种易受环境[3]、季节和病虫害的影响，而且传统的遗传育种有生长周期长、见效慢等缺点[4-5]。建立党参组织培养高频再生体系，可以为以后培育新的品种奠定基础。用党参种子培育无菌苗，再将获取的外植体用于组织培养显得至关重要。笔者研究了不同消毒方法对党参种子消毒效果的影响，探索出党参无菌苗培养前种子最佳消毒方法，为党参无菌苗的培育提供理论依据。

1材料与方法

1.1材料党参种子由佳木斯大学生命科学学院经济植物研究所提供。浸种消毒剂为10%H2O2、0.1%HgCl2和2%NaClO；表面消毒剂为75%乙醇；种子预浸泡处理采用无菌水；培养基为MS培养基。

1.2方法

1.2.1最佳消毒剂及消毒时间的选择。

该试验为2 因子试验，因子 1 为消毒剂，包括 3 个处理：10%H2O2、0.1%HgCl2、2%NaClO；因子2为消毒时间，即每种消毒剂分别处理10、20、30 min。共9个处理组合，每处理3次重复，每重复 50 粒种子。消毒后的种子用无菌水冲洗 5～6次，每次1～2 min，然后将种子接种于 MS 培养基，观察培养，计算党参种子的平均带菌率和平均发芽率。

1.2.2乙醇预处理的选择。

选籽粒饱满、大小基本一致的种子200粒，分为2组（即2个处理），每处理100粒种子，每处理3次重复，每重复 50 粒种子。处理 1：将种子在75%乙醇中预浸泡20 s，再用2%NaClO消毒处理；处理 2：种子不经过乙醇浸泡，直接用2%NaClO进行消毒。将不同处理的党参种子接种于 MS 培养基，对试验结果观察并记录。

1.2.3种子预浸泡的选择。选籽粒饱满、大小基本一致的种子450粒，分为3组（即3个处理），每处理 150 粒种子。处理 1：将种子用无菌水在常温下浸泡12 h；处理 2：将种子用无菌水在常温下浸泡 24 h；处理 3：种子不浸泡。将3个处理分别用75%乙醇浸泡20 s，再用2%的NaClO消毒20 min。最后将不同处理的党参种子接种于 MS 培养基，每处理3次重复，每重复 50 粒种子，用高分子膜封口，观察并统计试验结果。

2结果与分析

2.1不同消毒剂和消毒时间对种子消毒效果的影响

从表1可以看出，不同消毒剂处理的党参种子，表现出不同的效果。10%H2O2消毒10 min的种子发芽率为43.33%，培养基呈红色，污染十分严重，不利于无菌苗的种子培养，10%H2O2消毒20 min的种子发芽率为66.67%，较10%H2O2消毒10 min的种子发芽效果好，10%H2O2消毒30 min的种子发芽率为48.00%。0.1%HgCl2消毒10 min的种子发芽率为57.33%，0.1%HgCl2消毒20 min的种子发芽率为83.33%，0.1%HgCl2消毒30 min的种子发芽率为62.67%。可见，0.1%HgCl2消毒处理后的种子发芽率均高于用10%H2O2消毒处理后的种子发芽率。2%NaClO消毒10 min的种子发芽率为81.33%，2%NaClO消毒20 min的种子发芽率最高，为90.00%，2%NaClO消毒30 min的种子发芽率为80.00%。0.1%HgCl2消毒20 min的种子发芽率（83.33%）仅次于2%NaClO浸种20 min的种子发芽率（90.00%）。但是，将0.1%HgCl2浸种20 min和2%NaClO浸种20 min的消毒效果相比较，前者的污染率明显高于后者。综合以上结果，2%NaClO浸种20 min消毒效果最佳。

2.2乙醇预处理对党参种子消毒效果的影响

75%乙醇浸泡20 s与不浸泡党参种子2个处理的结果表明，75%乙醇浸泡20 s的种子平均带菌率低于不浸泡处理。由表2可知，75%乙醇浸泡20 s的种子平均带菌率为7.00%，比不浸泡处理低2.00百分点。而且，75%乙醇浸泡20 s的种子发芽率为91.00%，明显高于不浸泡处理。可见，75%乙醇浸泡20 s对种子消毒有很好的效果。

2.3预浸泡对党参种子消毒效果的影响

从表3可以看出，党参种子不浸泡处理的平均发芽率显著低于浸泡处理。未经过无菌水预浸泡处理的种子发芽率为86.00%，无菌水浸泡12 h的种子发芽率为92.00%，无菌水浸泡24 h的种子发芽率最高，为94.67%。不浸泡处理的种子带菌率比浸泡12 h的种子带菌率高2.00百分点，比浸泡24 h的种子带菌率高6.00百分点，浸泡24 h的种子平均带菌率最低，为1.33%。从以上结果可以看出，无菌水浸泡24 h能有效提高种子发芽率，同时降低种子带菌率。

3结论与讨论

该试验中HgCl2的消毒效果不如NaClO，虽然0.1%HgCl2消毒20 min的发芽率仅次于2%NaClO消毒20 min的处理，但HgCl2处理的种子污染率普遍高于NaClO处理。用10%H2O2对党参种子消毒处理时，消毒时间过短，培养基污染十分严重，消毒时间过长，种子会向外渗透营养物，所以不适宜选H2O2作为党参种子的消毒剂。试验发现，残留在种子上的消毒剂也会影响种子发芽率，所以，经過消毒剂处理后的种子要用无菌水冲洗5～6次，每次1～2 min。综合以上结果，用2%NaClO浸种20 min是最佳选择。

由试验结果可知，采用75%乙醇浸泡预处理种子，有效降低了种子带菌率，种子经75%乙醇浸泡预处理后再用2%NaClO消毒，比直接用2%NaClO消毒的种子带菌率低2.00百分点。而且75%乙醇浸泡预处理消毒后的种子发芽率为91.00%，比不浸泡处理的种子发芽率高6.00百分点。75%乙醇能有效降低种子表面的带菌率，但预处理时间不能太长，20 s为处理党参种子的最佳时间。

党参种子浸泡与否对消毒效果的影响研究表明，种子经浸泡后，其种皮结构变松软[6]，消毒剂更易渗入。在种子消毒之前，无菌水浸泡12 h后再经2%NaClO消毒的种子带菌率为5.33%，无菌水浸泡24 h后再经2%NaClO消毒的种子带菌率为1.33%，而未经过无菌水浸泡的种子带菌率为7.33%。发芽率最低的为不浸泡的种子，浸泡12 h的种子比不浸泡种子的发芽率高6.00百分点，浸泡24 h比浸泡12 h的种子发芽率高2.67百分点。可见，种子预浸泡能提高消毒剂的消毒效果，无菌水预浸泡24 h有效提高了种子发芽率。

参考文献

[1] 吴国平.浅谈党参研究进展[J].山东畜牧兽医，2015，36（12）：61-62.

[2] 宋晓燕.党参的研究进展[J].内蒙古中医药，2011，30（8）：112-113.

[3] 禹娟红.不同产地党参药材质量评价研究进展[J].中国中医药科技，2016，23（4）：503-504.

[4] 熊丽，吴丽芳.观赏花卉的组织培养与大规模生产[M].北京：化学工业出版社，2003：80-83.

[5] 周祖富.几种观赏花卉的组织培养和快速繁殖[J].基因组学与应用生物学，1992（2）：86-88.

[6] 胡重怡，郑少清，陈兴江，等.烟草无菌苗培养前的种子消毒技术研究[J].中国烟草科学，2007，28（2）：45-46.