利用酵母双杂交技术筛选卵菌效应因子互作蛋白概述

盛慧,陈姗姗,艾聪聪,冯锐,张修国



利用酵母双杂交技术筛选卵菌效应因子互作蛋白概述

盛慧,陈姗姗,艾聪聪,冯锐,张修国*

山东农业大学植物保护学院;山东省蔬菜病虫生物学省级重点实验室, 山东 泰安 271018

蛋白质是生命活动的执行者，其通过与DNA、RNA、蛋白质、脂类以及多糖等物质结合形成复合体以参与信号转导、防卫反应等复杂的生命活动，因此研究蛋白质之间相互作用可为揭示生命现象本质提供依据。酵母双杂交（Yeast two hybrid, Y2H）系统是筛选互作蛋白最常用的方法，它具快速、灵敏、简便、高效、广泛的优点。卵菌是一类危害严重的植物病原菌，可分泌效应因子，直接或间接与寄主体内的蛋白发生作用从而促进病原菌侵染与定植，引起寄主发病或者干扰、抑制寄主的抗病反应，但目前对于病原卵菌效应因子的寄主靶标以及效应因子增加寄主对病原菌的敏感性机制知之甚少，因此，利用酵母双杂交技术筛选植物病原卵菌效应因子互作蛋白，为探明其致病机制显得尤为重要。

酵母双杂交技术; 互作蛋白; 卵菌; 效应因子

生物信息学的发展极大地推动揭示了物种生命活动奥秘的进程，各种生命活动时刻存在着核酸、蛋白质等生物大分子之间的相互作用。蛋白质是生命活动的执行者，其通过与DNA、RNA、蛋白质、脂类以及多糖等物质结合形成复合体参与信号转导、防卫反应等复杂的生命活动，因此研究蛋白质之间相互作用可为揭示生命本质提供重要依据。基于分子生物学、生物化学、生物物理学等学科，已经建立了多种研究蛋白质互作的方法，包括酵母双杂交、免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation, Co-IP)、双分子荧光互补（Bimolecular fluorescence complementation, BiFC）、pull-down等，其中在1989年，由Fields和Song创立的酵母双杂交（Y2H）技术是研究蛋白质相互作用最常用的方法。

本文将从酵母双杂交技术的原理，酵母双杂交技术的优缺点以及利用酵母双杂交技术筛选互作蛋白应用等方面进行讨论。

1 酵母双杂交技术的原理

真核生物转录的起始需要反式作用因子的参与，许多反式作用因子往往是组件式的，由DNA结合结构域（DNA-binding domain，BD）和转录激活结构域（transcription-activating domain，AD）组成。酵母双杂交技术就是利用酵母反式作用因子的特性来进行蛋白质相互作用分析的系统[1,2]。其中酿酒酵母GAL4是最常用的反式作用因子。GAL4 BD与X蛋白融合表达构成BD表达载体，GAL4 AD与Y蛋白融合表达构成AD表达载体[3]，将这两种载体同时转化至经改造的酵母菌株中。由于这种菌株在正常情况下不能合成亮氨酸（Leu）、色氨酸（Trp）、组氨酸（His)与腺嘌呤（Ade），因此无法在缺乏这些营养物质的培养基上生长，只有当X与Y发生相互作用时，BD和AD在空间上接近，使反式作用因子具有转录活性，激活下游报告基因HIS3、URA3、LACZ的表达[4]（图1），从而通过功能互补和显色反应筛选到阳性菌落。

图 1 酵母双杂交技术原理[4]

DBD: DNA结合域; AD: 转录激活域; X: 诱饵蛋白; Y: 猎物蛋白; UAS: 上游激活序列

DBD: DNA binding domain; AD: activation domain; X: bait; Y: prey; UAS: upstream activating sequence.

2 酵母双杂交技术的优缺点

作为研究蛋白相互作用的主要方法，酵母双杂交系统的主要优点是:（1）酵母双杂交体系研究蛋白——蛋白相互作用的整个过程只对核酸进行操作，充分利用了成熟的核酸技术和酵母这一快速方便的操作体系，使得实验简单易行；（2）可直接从基因文库中寻找编码相互作用蛋白的DNA序列,而不需要分离纯化蛋白；（3）可研究蛋白之间的弱相互作用。在细胞内，弱相互作用与强相互作用一样起着极其重要的生物学作用。免疫沉淀法以及近来发展起来，都要求蛋白——蛋白相互作用强度足够大,而不能检测蛋白之间的弱相互作用。酵母双杂交体系中蛋白——蛋白相互作用发生在酵母细胞这一自然的状态下，使得该方法的灵敏度很高。

酵母双杂交技术具筛选效率高、可直接在核酸水平操作、接近植物细胞环境条件所编码的外源蛋白能够保持正确折叠方式等优点，但依然存在其局限性，具体为：（1）假阳性较高，文库蛋白含低亲和力区域，可以和多种诱饵蛋白互作；许多猎物蛋白本身是转录因子，发挥转录激活结构域的作用；目的蛋白能够与启动子区域进行非特异性结合，从而启动报告基因的转录；（2）并非能对所有蛋白质间的相互作用进行分析，各种酵母双杂交系统均有其适用范围，因此存在核表达体系和膜表达体系以适应不同蛋白互作验证；（3）大量外源基因的表达可能影响酵母报告基因正常表达，存在假阴性。因此，蛋白质间的相互作用还需其他方法加以验证提高其可靠性。

3 利用酵母双杂交技术筛选卵菌效应因子互作蛋白的研究进展

卵菌是一类危害严重、广泛分布的植物病原菌，给农作物产量、社会经济以及自然生态系统造成了巨大威胁。它是多分支的群体，包括60多种疫霉菌、多个活体营养的霜霉菌和100多种腐霉菌,其中许多是植物病原菌。其中影响最大的是由致病疫霉（）引起的马铃薯晚疫病，1846年曾导致爱尔兰饥馑，给欧洲大陆造成严重影响。其次影响较为严重的还有由大豆疫霉（）引起的大豆根茎腐病，由辣椒疫霉（）引起的辣椒疫病。研究发现卵菌可以分泌效应因子，最重要的两大类是RxLR效应因子和CRN效应因子。它们通过与寄主体内的蛋白相互作用从而促进病原物的侵染与定植，引起寄主发病或者是干扰、抑制寄主的抗病反应，但目前对于病原物的效应因子的靶标和致病机制还缺乏相应的研究，因此利用酵母双杂交技术筛选效应因子在寄主体内的互作蛋白对于揭示其致病机制尤为重要。

3.1 利用酵母双杂交技术筛选致病疫霉效应因子互作蛋白的研究进展

致病疫霉菌寄主范围较窄，主要侵染茄科植物，马铃薯晚疫病和番茄疫病，给世界经济造成重大损失。作为研究最早、最为深入的一类效应因子，目前已经发现多种致病疫霉效应因子，通过酵母双杂交技术筛选到其互作蛋白的方法也得到广泛应用。如Bos等通过此方法在马铃薯与致病疫霉互作的库中筛选到了一个与AVR3a互作的E3泛素连接酶CMPG1,进一步研究证明AVR3a是通过与CMPG1互作，钝化和抑制其E3泛素连接酶活性，从而操纵植物正常蛋白降解系统[5]；Pi04089可以与马铃薯K-同源（KH）RNA结合蛋白StKRBP1发生相互作用促进马铃薯晚疫病的发生[6]；Pi03192阻止两种植物NAC转录因子从内质网重新定位到细胞核从而促进其侵染[7],；AVR2与植物磷酸酶BSU-LIKE PROTEIN1（BSL1）结合以介导疾病抗性[8]；AVR1与胞囊成分Sec5相互作用以操纵植物免疫[9]，Pi04314与三种宿主蛋白磷酸酶（PP1c）异构体相互作用，使它们从核仁重新定位到核质从而促进晚疫病的发生[10]；PexRD2与宿主丝裂原活化蛋白激酶MAPKKKε相互作用以抑制植物免疫信号的传导[11]。由此我们可以发现，致病疫霉的致病机制是错综复杂的，它可以产生多种效应因子，与相关的酶或者转录因子等寄主体内的蛋白发生相互作用，从而促进其侵染，引起寄主植物发病，而酵母双杂交技术作为筛选众多效应因子互作蛋白的第一步而发挥着尤为重要的作用。

3.2 利用酵母双杂交技术筛选大豆疫霉菌效应因子互作蛋白的研究进展

大豆疫霉菌引起的大豆根茎腐病是大豆上极具毁灭性的病害之一，在大豆的整个生育期均可发生，每年给全球大豆生产造成的损失超过10亿美元。生物信息学发现大豆疫霉基因组中RxLR效应基因超过350个[12]，CRN效应基因大概200多个，如此多的效应因子如何操纵寄主植物促进其侵染尚无定论。目前通过酵母双杂交技术以及后续的研究发现PsAvr3c可有效结合并稳定大豆富含丝氨酸/赖氨酸/精氨酸的蛋白质GmSKRPs，重新编程宿主前mRNA剪接以破坏免疫[13]；CRN108与HSP（热激蛋白）启动子的保守元件HSE结合，从而干扰转录因子与后者的结合，从而抑制HSP基因家族的表达，干扰HSP介导的抗病信号通路[14]；Avr1k可以与植物细胞程序性死亡过程中的重要调控蛋白Pirin发生相互作用来抑制植物的PTI[15]；PsAvh94可以与MAPK信号级联反应途径上的重要组分NbMKK1发生相互作用而阻断植物MAPK信号通路，从而干扰寄主的防卫反应[16]；苯丙氨酸组氨酸解氨酶PAL是苯丙烷类代谢途径中最重要的酶，其活性与植物抗病性有着密切的关系，Avh238与PAL互作来抑制植物的抗病反应[17]；类似于AVR3a，Avrld也能够和E3泛素连接酶发生互作来侵染寄主植物[18]。在寄主植物与大豆疫霉的长期竞争过程中，寄主植物进化出多种识别病原物阻止其侵入机制，而大豆疫霉则分泌效应因子，通过效应因子与寄主植物体内的相关蛋白发生作用，调控相关基因的表达或者抑制植物的程序性细胞死亡来躲避寄主植物的识别，抑制植物防卫反应。

3.3 利用酵母双杂交技术筛选辣椒疫霉菌效应因子互作蛋白的研究进展

辣椒疫霉菌引起的辣椒疫病是世界内广泛发生的毁灭性土传病害，在短期内即可暴发成灾，其寄主广泛，主要侵染叶、果实和茎，引起软腐、倒伏，可减产50％以上。以PcAvh1为诱饵蛋白通过酵母双杂交从本氏烟cDNA文库中筛选到PP2A-1和PP2A-2(蛋白磷酸酶2A的调节亚基及其同源异构体)，经后续研究发现它们之间的互作抑制植物的程序性死亡[19]；PcAvr3a12靶向并抑制植物肽基-脯氨酰顺反异构酶抑制内质网介导的免疫[20]；PcRxLR207与RBPs互作，可能通过改变RBPs的定位来降低其活性从而导致植物生长异常，促进辣椒疫霉的侵染[21]；在辣椒疫霉中与致病疫霉PiAvr3a相似的RXLR分泌蛋白PcAvr3a12可以靶向内质网定位蛋白FKBP15-2来促进其侵染[22]；叶廷跃等人通过酵母双杂交技术筛选并验证了RxLR103能与EDS1、BAK1、BIK1、NPR3互作，RxLR172能与EDS1、SGT1b互作，RxLR48能与NPR1互作，为后续研究奠定了基础[23]。与上述两种卵菌相比，目前对于辣椒疫霉菌的研究相对较少，对其致病机制缺乏系统的了解，但上述一系列研究给我们提供了思路与依据，我们可以利用酵母双杂交技术及后续研究筛选并研究其互作蛋白及致病机制。

4 展 望

本文阐述了酵母双杂交技术的原理，利用酵母双杂交技术筛选互作蛋白的优缺点以及研究进展。近些年，随着病原卵菌全基因组测序的接续完成和实验技术的不断完善，依托基因组数据库分析得到的与致病性相关的基因研究也不断取得进展。卵菌效应因子的功能成为研究的焦点，通过研究发现，卵菌的致病机制是错综复杂的，它可以分泌多种效应因子，与寄主植物的多种蛋白发生相互作用，促进或者抑制各种信号途径，这也正是其发病快，危害严重，难防难治的重要原因。目前对于致病疫霉与大豆疫霉的研究比较深入，但是对于辣椒疫霉以及其他疫霉还缺乏系统的研究，酵母双杂交技术作为一种为研究蛋白质相互作用的方法，虽然有一定的局限性，但是因为其简便、快速、高效的特点，在以后的研究中必将继续发挥重要作用。

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A Review of Interaction Proteins of OomyceteEffectors Screened by Yeast Two Hybrid System

SHENG Hui, CHEN Shan-shan, AI Cong-cong, FENG Rui, ZHANG Xiu-guo*

271018,

Protein is the executor of life activities, which combines with DNA, RNA, proteins, lipids and polysaccharides to form complexes to participate in complex life activities such as signal transduction and defense reactions. Therefore, studying the interaction between proteins can provide a basis for revealing the nature of life phenomena. The yeast two-hybrid (Y2H) system is the most commonly method for screening interacting proteins, and it has the advantages of being fast, sensitive, simple, efficient and extensive. Oomycetes are a kind of serious plant pathogens, which can secrete effectors, promote the infestation and colonization of pathogens by interacting with proteins in the host, causing host disease or interference and inhibiting the host disease resistance response. However, little is known about the host target of pathogen effector and the mechanism by which the effector increases the host's sensitivity to pathogens. Therefore, it is particularly important to screen the ovarian effector interacting protein by yeast two-hybrid technique.

Yeast two hybrid system; interaction proteins; oomycetes; effectors

S961.5

A

1000-2324(2019)03-0357-04

10.3969/j.issn.1000-2324.2019.03.001

2018-08-23

2018-10-06

国家大宗蔬菜产业技术体系(CARS-25-03B)

盛慧(1997-),女,硕士研究生,研究方向:植物病原真菌学和真菌资源利用. E-mail:15646700228@163.com

Author for correspondence.E-mail:zhxg@sdau.edu.cn