硝酸银滴定液指示剂法测定兽药盐酸氯苯胍中含氯量的方法验证

(浙江汇能生物股份有限公司，浙江 海宁 314422)

盐酸氯苯胍(Robenidine hydrochloride)又名1,3-双[(对氯亚苄基)氨基]胍盐酸盐，属胍盐衍生物，分子式为C15H13Cl2N5·HCl，分子量为370.66。盐酸氯苯胍作为广谱抗球虫药被用于预防和治疗鸡、兔等动物的球虫病，对柔嫩艾美耳球虫、毒害艾美耳球虫、堆型艾美耳球虫等均有效果[1-3]。《中国兽药典》(2015版)在盐酸氯苯胍质量标准要求【检查】项中规定了其含氯量的滴定检测方法，该方法需使用到两种化学检测试剂，即二苯偕肼(用作指示剂)和硝酸汞(用作滴定液)。硝酸汞是一种剧毒危化品，在我国被严格管控，购买十分困难，给盐酸氯苯胍生产或使用单位开展对该药的经常性质量监测带来极大不便，找出一种能替代硝酸汞滴定法的检测方法尤为必要。

目前已有采用硝酸银滴定法检测工业循环冷却水和锅炉用水中氯离子的方法报道(GB/T 15453-2008)。虽然硝酸银属于易制爆危险化学品，但和硝酸汞相比易于购买，毒性亦较低。本试验建立了一种以硝酸银作为滴定液、以荧光黄作为终点指示剂的盐酸氯苯胍中含氯量的检测方法，该检测方法结果准确可靠。该方法不仅可替代硝酸汞滴定法，也有利于保障检验人员的健康。

1 试剂与方法

1.1试剂 硝酸银滴定液(0.10225 mol·L-1)：取硝酸银17.5 g，加水适量使溶解成1000 mL，摇匀。取在110℃干燥至恒重的基准氯化钠约2.0 g，精密称定，加水50 mL使溶解，再加糊精溶液5 mL，碳酸钙0.1 g与荧光黄指示剂8滴，用本液滴定至浑浊液由黄绿色变为微红色。每1 mL硝酸银滴定液(0.1 mol/L)相当于5.844 mg的氯化钠。

硝酸汞滴定液(0.05002 mol·L-1)：取硝酸汞17.2 g，加水400 mL和硝酸5 mL溶解后，滤过，再加水适量使成1000 mL，摇匀。取在110℃干燥至恒重的基准氯化钠约0.15 g，精密称定，加水100 mL使溶解，加二苯偕肼指示液1 mL,在剧烈振摇下使用本液滴定至淡玫瑰紫色。

荧光黄指示剂：取荧光黄0.1 g，加乙醇100 mL使溶解。

糊精：取糊精2.0 g，加100 mL水加热溶解，冷却摇匀。

二苯偕肼指示液：取二苯偕肼1.0 g，加乙醇100 mL使溶解，摇匀；使用时再取上液1 mL，加乙醇至5 mL，摇匀得0.2%二苯偕肼指示剂。

盐酸氯苯胍样品来源：样品1和样品2来源于浙江汇能生物股份有限公司，样品3来源于国内某公司。

其余试剂均为分析纯，乙醇纯度95%，试验用水均为纯化水。

1.2 试验方法

1.2.1 硝酸银滴定法取干燥至恒重的盐酸氯苯胍样品约0.30 g，精密称量后，加入50 mL乙醇加热溶解。冷却后，加入2 mL荧光黄指示剂和5 mL 2% 糊精(m∶v)，用硝酸银滴定液滴定至终点，每1 mL硝酸银滴定液(0.1 mol·L-1)相当于3.545 mg的Cl。

1.2.2硝酸汞滴定法 按《中国兽药典》一部(2015版)的检测方法进行。取干燥至恒重的盐酸氯苯胍样品约 0.30 g，精密称定，置于50 mL乙醇中加热使溶解, 冷却后加入0.2%二苯偕肼指示液2 mL, 用硝酸汞滴定液滴定至溶液显浅玫瑰红色。每1 mL硝酸汞滴定液(0.05 mol·L-1)相当于3.545 mg的Cl。

2 结果与讨论

2.1方法学验证

2.1.1回归方程 参照商军等[4]的方法进行。盐酸氯苯胍供试品经干燥至恒重，每个样品称取7份，使硝酸银滴定液体积分别达到滴定管体积的20%、30%、40%、50%、70%、80%和90%(滴定管容积为10 mL)。记录滴定终点时所需硝酸银的体积，以滴定液体积(vi)为纵坐标，供试品的质量(mi)为横坐标，采用EXCEL表进行回归分析，获得回归方程。如图1所示，三个样品回归方程的相关系数平方(R2)均接近1。

2.1.2成比例的系统误差分析 根据前述回归方程，计算试验获得的回归系数(bobs)与理论值“btheory”。对于指示剂法，测定的“bobs”与理论值“btheory”之间的相对偏差应不得超过0.5%[5]。根据所用硝酸银滴定液的摩尔浓度和盐酸氯苯胍的相对分子量计算得出btheory=26.385 mL·g-1。根据所获得的线性回归方程可知，3个样品的回归系数bobs分别是26.455、26.47和26.514，按[(bobs-btheory)/btheory]×100%公式计算测定值与理论值之间的相对偏差分别为0.265%、0.322%和0.489%，均不超过0.5%(表1)。

2.1.3额外的系统误差分析 指示剂法获得的回归方程截距(aobs)应不得超过预期或目标滴定体积“VT”的0.6%[5]。本方法规定供试品取样量为0.3 g，预期或目标滴定VT为7.92 mL(VT=26.385×0.3)。根据线性回归方程，样品1、样品2和样品3测定的回归曲线的aobs分别为0.0442、0.0347和0.0194，按(aobs/VT)×100%计算，额外的系统误差分别为0.558%、0.438%和0.245%(表2)，均未超过0.6%。

表1 成比例的系统误差分析结果

2.1.4精密度分析 精密度即统计学误差，采用指示剂法时，统计学误差应不超过0.5%[5]。计算公式如(1)、(2)和(3)所示：

(1)

(2)

Sdd=∑(Vi-aobs-bobs×mi)

(3)

式中SD为标准偏差估计值；Vi为消耗的滴定液体积；mi为供试品的称样量，n为滴定的次数。

按上述公式计算，三个供试品的SD分别为0.01006、0.00775和0.00988，统计学误差分别为0.127%、0.098%和0.125%(表2)，均未超过0.5%。

2.1.5回收率试验 取样品1进行加标回收试验，标准氯选用110℃干燥至恒重的基准氯化钠。前述检测表明该样品中含氯量为9.7%，试验中向该样品中添加分别相当于其含氯量的80%、100%和120%的氯，采用硝酸银滴定法检测氯含量，计算氯的回收率。检测结果表明，样品中氯的平均回收率达 99.4%(表3)，表明该检测方法成立。

表2 额外的系统误差和精密度分析结果

表3 加标回收率试验结果

2.2硝酸银滴定法与硝酸汞滴定法检测结果对比 用《中国兽药典》一部(2015版)要求的方法和本试验建立的方法分别对盐酸氯苯胍样品1和样品3进行5次平行测定，测得的氯含量见图2。结果表明，两种滴定方法测得的氯含量无显著差异(P>0.05)。表明本试验建立的硝酸银滴定法可用于检测盐酸氯苯胍中氯含量。

A:《中国兽药典》(2015版)要求的检测方法；B：本试验建立的方法。NS：差异不显著(P>0.05)(n=5)图2 样品氯含量两种方法检测结果的比较

3 结论

综上，本试验通过成比例的系统误差、额外的系统误差、统计学误差和加标回收试验分析，证实所建立的以硝酸银为滴定液、以荧光黄作为终点指示剂的盐酸氯苯胍中氯含量的滴定检测方法精密度高、重复性好、方法可靠。此外，本试验建立的硝酸银滴定法与《中国兽药典》一部(2015版)要求的硝酸汞滴定法对同一样品的检测结果无显著差异。上述结果表明，本试验建立硝酸银滴定法可以替代硝酸汞滴定法用于盐酸氯苯胍中氯含量的检测。