金华猪与长白猪肠道IL-17C表达差异研究

罗 雨，许 佳，张超颖，蒋春燕，章红兵

(金华职业技术学院农业与生物工程学院动物医学检测中心，浙江 金华 321000)

白介素-17(IL-17)细胞因子家族包括6个成员：IL-17A、IL-17B、IL-17C、IL-17D、IL-17E(也称 IL-25)和 IL-17F[1]。IL-17C主要表达于肠道等粘膜组织中的上皮细胞，能诱导紧密连接蛋白及抗菌蛋白的表达进而调节肠粘膜免疫[2-4]。本实验室前期研究发现，猪肠上皮细胞系IPEC-J2在细菌感染后能通过上调IL-17C的表达进而促进粘膜免疫[5]。金华猪，又称“金华两头乌”，是我国著名的优良猪种之一，具有肉质好、繁殖率高、抗逆性强等优良特性。长白猪具有生长速度快和饲料利用率高，但该品种抗病能力相对较差[6]。为进一步研究IL-17C在猪肠道免疫中的作用，本文对比分析了IL-17C细胞因子在金华猪与长白猪肠道中的表达特性，以期从分子水平揭示两品种猪抗病性能差异的原因。

1 材料与方法

1.1样品采集 选取180 日龄去势金华公猪和长白公猪各6头，屠宰后分别采集空肠及回肠中段组织。用预冷的生理盐水冲洗掉内容物后，分别浸入于含TRIzol Reagent(Thermo Fisher Scientific)的1.5 mL EP管中或者含甲基纤维素(Sigma-Aldrich)的平底冻存管中，然后投入液氮中迅速冷冻后置于-80℃冰箱保存。

1.2qRT-PCR 按照Trizol Reagent的操作说明提取肠道组织中的总RNA，选取1 μg纯化后的总RNA反转录合成cDNA，然后以GAPDH和β-actin为内参基因，利用qRT-PCR方法检测IL-17C mRNA在金华猪与长白猪空肠及回肠中的表达量。引物及退火温度见表1，具体操作方法参考文献[5]。

表1 荧光定量PCR引物序列

1.3肠道组织切片及染色镜检 切片制作及染色方法参考文献[7]，一抗与荧光二抗分别为兔抗-IL-17C (1:1000，ab153896，Abcam)及羊抗兔异硫氰酸荧光素荧光二抗(碧云天)。染色完成后用0.223 M 1,4-二氮杂二环 [2.2.2] 辛烷(Sigma-Aldrich)的甘油封片后荧光显微镜镜检(奥林巴斯BX43)。

1.4数据分析 应用SPSS 22软件进行Mann-Whitney U检验和Friedman′s测试，所有数据以“平均值±标准误差”表示，P<0.05表示差异显著，P<0.01表示差异极显著。

2 结果

2.1IL-17C基因在不同肠道中的表达 由图1可见，IL-17C基因在金华猪及长白猪空肠及回肠中均有表达，且在不同品种间存在差异。金华猪肠道IL-17C基因表达量均高于长白猪，其中在空肠中的表达量显著高于长白猪(P<0.05)。同时，两品种猪IL-17C基因在不同肠道部位的表达存在明显差异，回肠中的基因表达量显著高于空肠(P<0.01)。

图1 IL-17C基因在金华猪和长白猪肠道中的表达(不同字母代表差异显著)

2.2IL-17C蛋白在空肠中的表达 免疫荧光结果显示，金华猪IL-17C蛋白在空肠中的表达显著高于长白猪，且主要集中于隐窝处(图2，右向箭头所示)。此外，在金华猪肠绒毛上皮细胞中也发现有IL-17C的表达(图2，左向箭头所示)，而在长白猪肠上皮细胞中未发现该蛋白的存在。

图2 金华猪及长白猪空肠中IL-17C蛋白免疫荧光检测

3 讨论

IL-17C基因在肠道中的主要作用是调节炎症反应和维持粘膜屏障功能[8]。目前，关于IL-17C及其肠道免疫调节的研究主要集中于人及小鼠模型中。本团队前期研究表明，IL-17C基因能表达于猪肠上皮细胞系IPEC-J2中[5]。本试验进一步研究了IL-17C在猪肠道组织中的分布规律，发现IL-17C细胞因子在金华猪及长白猪肠道中的表达存在明显差异。在金华猪肠道内，尤其是空肠IL-17C的表达量显著高于长白猪。IL-17C主要表达于隐窝处的肠上皮细胞，与在人肠道中的研究结果一致[9]。有研究表明，金华猪肠道内β-防御素-2 (pBD-2)等防御蛋白的水平显著高于长白猪[10]。在猪肠上皮细胞中，IL-17C能够调控黏膜免疫相关基因(pBD-2，mucin-2，claudin-1和claudin-2)的表达，进而能有效抵抗细菌的感染和入侵[5]。因此，IL-17C可能在猪肠道先天免疫中发挥着重要的作用。IL-17C在金华猪及长白猪肠道的表达差异可能从分子水平阐释了地方品种猪抗病力优于引进品种猪的机制。本研究为进一步研究不同品种猪肠道免疫力及抗病力之间的关系奠定基础。