一种快速确证冰鲜三文鱼中孔雀石绿及其代谢物残留量的分析方法

祝伟霞＊， 孙转莲， 张丹， 冯景菲， 杨娜

(郑州海关技术中心，郑州450003)

1 引言

三文鱼属冷水性高度洄游鱼类，是世界名贵鱼类之一，三文鱼以其独特的口味、丰富的营养，受到越来越多人的青睐，进口量也快速增长。据联合国粮农组织统计，目前全球超过70%三文鱼来自于水产养殖业[1]。孔雀石绿属碱性三苯甲烷类合成化学染料，主要用于防治鱼类的水霉病、烂鳃病以及寄生虫病[2]。孔雀石绿在水生生物体内可快速代谢为隐色孔雀石绿，研究证明孔雀石绿及其代谢物具有致癌、致突变、致畸的危害，在水生动物体内残留时间长，已成为近年来水体污染和水产品质量安全的重点监控污染物[3]。为人类身体健康，我国农业部于2002年第193号公告禁止将孔雀石绿作为杀虫和杀菌剂用于所有食品用动物，欧盟、日本、美国也禁止孔雀石绿用于水产养殖过程中。我国是三文鱼的主要进口国家，保障进口食品的质量安全，建立一种有效检测孔雀石绿及其代谢物的方法具有非常重要的现实意义。

目前有关孔雀石绿及其代谢物的研究报道主要采用液相色谱法（HPLC）[4-7]和液相色谱质谱/质谱法[8-11]。孔雀石绿及其代谢物具有不同的特征吸收，孔雀石绿特征吸收在618 nm可见光区，其代谢物特征吸收在267 nm紫外光区，同时具有荧光激发和发射波长，HPLC法同时测定两种化合物时需要紫外串联荧光检测器才能完成[4]。国家标准GB/T 19857-2005采用柱后衍生的方法，在PbO2作用下检测孔雀石绿的总量。为了提高分析灵敏度，HPLC-MS/MS技术开始用于养殖环境[8-10]、水产生物[3,11]中痕量孔雀石绿及其代谢物的分析，目前很少有关三文鱼中孔雀石绿及其代谢物残留量分析的文献报道。本方法根据冰鲜三文鱼样品的特点，设计了一种高选择性的固相分散萃取净化方法，可以快速、灵敏测定冰鲜三文鱼中孔雀石绿及其代谢物总残量。

2 实验部分

2.1 仪器和试剂

API 5500Q液相色谱-串联线性离子阱质谱联用仪(美国AB公司)，配Waters超高效液相色谱仪和电喷雾离子源；T18涡旋混匀器(德国IKA公司);8210 型水浴超声波装置(日本Yamato公司)；日立5810型离心机（日本hitachi 公司）；OA-SYS 氮气浓缩仪 (美国Organomation公司)。草酸孔雀石绿(malachite green，MG)、隐性孔雀石绿(1eucomalaehite green，LMG)标准品，纯度≥91%，购自美国Sigma-Aldrich公司，50 μg/mL孔雀石绿同位素内标（MG-D5）和50 μg/mL隐性孔雀石绿同位素内标（LMG-D6）标准溶液均购于农业部农产品质量标准研究中心。C18键合相填料粉(美国Agilent公司)；甲酸(96%)、乙酸铵和乙腈(色谱纯,美国Fisher公司)；中性氧化铝（天津科密欧公司，100目～200目），其它试剂均为分析纯；水为Millipore纯水系统制得高纯水(≥18MΩ/cm)。

表1 孔雀石绿及其代谢物质谱参数Table 1 Mass parameters of MG and LMG Compounds Parent ions Product ions Chemical Formula CE(V)CXP(V)

2.2 标准溶液的配制

分别称取按质量折算为100%纯度的标准品10 mg于100 mL容量瓶中，加入乙腈溶解并定容至刻度，该标准储备溶液浓度为100 μg/mL，-18℃以下保存，有效期为6个月。取标准储备液用乙腈配制成质量浓度为1.0 μg/mL中间标准工作溶液，2℃～4℃保存，有效期为1个月。取标准储备液用乙腈-0.1%甲酸(1+1,V/V)稀释质量浓度为0.5 μg/mL的质谱调谐溶液，现用现配。取适量的MG-D5和LMG-D6内标标准溶液用乙腈逐级稀释，制得MG-D5 25 ng/mL、LMG-D6 100 ng/mL的混合内标标准溶液，2℃～4℃保存，有效期为1个月。

2.3 仪器条件

色谱柱：CAPCELL PAK MGⅡ (150 mm 2.1 mm id,5 μm)；柱温:30 ℃；流动相A：乙腈，B:0.1%甲酸溶液；洗脱梯度程序：0 min(80%A)，保持0.5 min；0.5 min～2.5 min(40%A)；2.5 min～4.0 min(5%A)保持2 min；6.0 min～6.1 min(80%A)，保持4 min 流速：0.3 mL/min;进样量:10 μL。

电喷雾离子化方式下正离子电离(ESI+)；雾化气：379 kPa(55 psi)；气帘气:241 kPa(35 psi)；喷雾电压：5500 V；去溶剂温度：550 ℃；去溶剂气：379 kPa(55 psi)；碰撞气：69 kPa(8 psi)；离子对驻留时间：60 ms；去簇电压(DP)：120 V，射入电压(EP)：10 V，碰撞能量(CE)、碰撞室出口电压(CXP)和其它质谱参数见表1。

2.4 样品前处理

称取5.0 g样品置于50 mL离心管中，加入100 μL混合内标溶液，加入0.5 g抗坏血酸、1 mL0.1 mol/L乙酸铵溶液、20 mL乙腈，涡旋混匀3 min，常温水浴超声10 min，取出加入2.0 g氯化钠、0.5 g C18粉，涡旋混匀3 min，静置5 min确保样液充分与填料接触，以4000 r/min离心5 min，转移上清液于另一离心管中，再加入5 g中性氧化铝粉，涡旋混匀3 min，静置5 min确保样液充分与填料接触，以4000 r/min离心2 min，取4 mL上清液氮吹浓缩至0.3 mL左右，用0.1%甲酸定容至1 mL，经0.22 μm滤膜过滤，供HPLC-MS/MS测定(实验需要在避光下操作)。

3 结果与讨论

3.1 样品提取条件的选择

极性物质孔雀石绿在三文鱼体中很快代谢为弱极性隐性孔雀石绿，孔雀石绿的残留以孔雀石绿及其代谢物的总和计算。两种分析物的化学性质不稳定，易发生去甲基化和氧化降解反应，提取时需要加入还原剂防止降解。对比了添加抗坏血酸和未添加的效果，结果表明添加，样品中添加抗坏血酸后回收率提高20%，所以本方法提取时加入抗坏血酸还原剂。为兼顾孔雀石绿易溶于水和极性有机溶剂、隐色孔雀石绿易溶于有机溶剂的特性，对比了甲醇、乙腈两种有机溶剂的提取效果，结果表明乙腈提取时共萃物少，最终选择将乙腈作为提取溶剂。

3.2 提取环境的优化

孔雀石绿及其代谢物属光、热和氧气敏感物质，易产生降解物。试验对比了两种操作条件下的实验效果：A光照+60℃水浴超声环境，B避光+常温超声。A条件下两种分析物的平均回收率45.7%，B条件下两种分析物的平均回收率76.3%，最终实验选择在避光、常温水浴条件下进行操作。

3.3 净化方法的选择

三文鱼中约含8%脂肪，在进行质谱测定前需要采用合适的净化方法去除基质脂肪及其它干扰物。试验了正己烷液液萃取、C18粉+氯化钠盐析法、C18粉+氯化钠盐析法+中性氧化铝净固相分散法的萃取效果，结果如图1所示，在正己烷液液萃到过程中，亲脂性LMG部分转移至正己烷层，导致LMG回收率下降34.1%。C18粉和中性氧化铝联合前处理方法，可去除样品中芳香族和脂肪族的干扰物质，回收率高，有效降低了基质效应。

图1 在不同净化条件下的测定三文鱼的结果Fig.1 Analysis results of salmon sample in the different purification conditions

3.4 质谱条件的优化

由于孔雀石绿及其代谢物结构中存在易电离的氨基，采用0.5 μg/mL的质谱调谐溶液在正离子模式下进行母离子全扫描时，结果显示化合物获得信号强度较高的[M+H]+分子离子峰。以[M+H]+为母离子,进行子离子全扫描，孔雀石绿及其代谢物碎片裂解主要是由脱甲基、苯环断裂形成（见表1），根据2002/657/EEC关于确证法4个确证点的要求，选取丰度较强、干扰较小的两对子离子进行检测，并优化DP、CE、EP、CXP、电喷雾电压、离子源温度、雾化气和气帘气等参数，获得2.3节所述的质谱参数。

3.5 稳定性测试

为了测定孔雀石绿及其代谢物的稳定性，分别将浓度为100 μg/mL标准储备溶液、1 μg/mL标准工作溶液、10 ng/mL基质标准工作溶液在室温、2℃～4℃和≤-18℃储存条件下的进行稳定性测试。试验数据表明不同储存条件影响MG和LMG的稳定性，在≤-18℃条件下储存，100 μg/mL标准储备溶液6个月内未出现降解，1 μg/mL1个月内响应值未发生变化，10 ng/mL基质标准工作溶液在室温下12小时后发生降解，2℃～4℃下24小时发生降解。

3.6 线性范围和方法检测限

阴样品基质溶液配制标准工作溶液浓度为0.2 μg/kg、0.5 μg/kg、1.0 μg/kg、5.0 μg/kg、20.0 μg/kg，分别以定量离子对与内标物的峰面积比(纵坐标Y)对浓度(横坐标X)进行线性回归计算，线性方程分别为Y=1.47X+0.0884（相关系数r=0.9996）和Y=0.67X-0.0822（相关系数r=0.9980）。以信噪比(S/N)≥3确定方法定性检出限(LOD)，以(S/N)≥10为方法定量检测限(LOQ)，经计算：孔雀石绿及其代谢物LOD为0.1 μg/kg，LOQ为0.5 μg/kg。

3.7 回收率和精密度

取阴性三文鱼样品添加3个水平标准工作溶液(1×LOQ、2×LOQ、4×LOQ)进行回收率试验。每个添加水平平行测定10次，MG方法回收率范围及RSD为87.6%～105.7%（4.7%～7.5%），LMG方法回收率范围及RSD为91.4%～102.8%（3.3%～6.8%），阴性样品添加回收色谱图见图2。

图2 阴性样品添加0.5μg/kg回收选择离子流色谱图Fig.2 The MRM chromatograms of spiked 0.5 μg/kg negative salmon sample

4 结论

建立了一种同时定量与定性测定冰鲜三文鱼中孔雀石绿及其代谢物总残量的分析方法，方法的各项参数经验证后均符合相关法规要求。根据孔雀石绿及其代谢物特殊的物理化学性质，方法采用分散固相萃取法净化，在进行测定时三文鱼样品基质影响小，内标法定量准确，可以作为我国进口冰鲜三文鱼的确证方法。