维生素D的检测方法及其在药品、食品、饲料、化妆品与临床研究中的应用进展

林 红，李忠红

1福建省食品药品质量检验研究院，福州 350001；2江苏省食品药品监督检验研究院，南京 210029

维生素D是固醇类衍生物，是一种重要的脂溶性营养素，以维生素D3（胆钙化醇）和维生素D2（麦角钙化醇）两种形式存在。维生素D主要通过膳食摄入和紫外线照射下在体内合成[1]，其本身无活性，需在体内经过肝脏和肾脏羟基化后才能生成具有生物活性的1，25-二羟基维生素D。有关维生素D3的合成以及体内维生素D2与D3的代谢转化示意图见图1[2]。虽然1，25-二羟基维生素D的生物活性最强，但25-羟维生素D是维生素D在人体代谢循环中的主要形式，因此常作为评价体内维生素D营养水平的指标。维生素D具有调节体内钙、磷代谢水平，维持血浆钙、磷水平稳定，促进牙齿和骨骼生长等重要作用，因此体内维生素D水平与一系列骨科疾病[3-5]相关。

随着对维生素D作用研究的深入，有越来越多的研究表 明，维生素D涉及的功能还有影响细胞增殖分化、细胞凋亡、免疫调节[6]、基因组稳定、神经发生等，现有的对疾病的研究结果已经可以证明，维生素D缺乏与心脏病[7]、肺病、癌症[8-9]、Ⅱ型糖尿病[10-12]、高血压、精神类疾病[13]、多发性硬化、免疫疾病[14]、肥胖症[15，16]、家族性地中海热[17]、过敏性疾病[18，19]、生育相关疾病[20]、原发性痛经[21]等均存在一定关联。因此，维生素D及其体内代谢物的检测方法 （统称为维生素D检测方法）研究一直受到广大科学工作者的重视，检测方法在不断发展，应用也日益广泛。

维生素D的检测方法目前主要有高效液相色谱-紫外检测法（HPLC-UV）、液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS），以及各种免疫分析法，包括放射免疫法（RIA）、酶联免疫吸附法（ELISA）、化学发光免疫测定法（CLIA）、电化学发光免疫测定法（ECLIA）、全自动生化分析法等。根据检测的目的以及检测样本中维生素D的含量水平，可以选择不同的方法。

1 药品、食品、饲料

含有维生素D的药品、食品（包括保健食品）、饲料，作为维生素D强化补充剂，其中维生素D含量能达到一定水平，维生素AD软胶囊中每粒含维生素D 300～1 000单位 （每单位相当于维生素 D 0.025μg，即为 7.5～25μg/粒），维生素 AD滴剂每 1 g 含维生素 D 500～5 000 单位（12.5～125μg·g-1），复合维生素注射液中维生素D含量为100μg·mL-1[22]；婴儿配方乳粉中维生素 D 添加量一般在 7.8～9.0 μg/100 g[23，24]；作为保健食品的钙片中维生素D含量在1.4～4.7μg·g-1[25]；饲料中维生素 D 的添加量在 1000～2000 IU·kg-1（相当于 2.5～5.0μg/100 g）[26]。对于这些样品中维生素D的检测首选HPLC法。《中国药典》2015年版四部通则0722维生素D测定法就是收录的HPLC法[27]。而不作为维生素D强化补充剂的普通食品中的维生素D的检测，则需要使用LC-MS/MS法。

食品中维生素D的测定有国家标准GB5009.82-2016，食品中维生素A、D、E的测定[28]，其中收录了两种测定方法，并规定液相色谱-质谱联用法适用于食品中维生素D2和维生素D3的测定，高效液相色谱法适用于配方食品中维生素D2或维生素D3的测定。

在饲料中，维生素D3的测定标准GB/T 17818-2010[29]中收载了两种色谱方法：正相高效液相色谱法（硅胶Si60柱，以正己烷-1，4-二氧六环为流动相）和反相高效液相色谱法（RP-HPLC，C18柱，甲醇-水为流动相），样品的前处理方法与《中国药典》基本相同。

近年来，因为食品（包括配方食品）样品前处理方法较繁琐，不断有人探索使用二维色谱与液相色谱-质谱联用方法检测食品中的维生素D，也都取得了较好的结果。

表1中汇总了近年来维生素D测定法在药品、食品、饲料中的一些应用。

续表1

2 化妆品

我国《化妆品安全技术规范》（2015年版）[48]规定，维生素D2和维生素D3为化妆品的禁用物质，并对检测方法做出了相关规定。齐晓飞等[49]采用高效液相色谱法对某化妆品进行了检测，该方法对色谱柱的分离性能要求较高，其研究采用的STPAK C18-ES Tech Mate（北京泰克美科技公司）色谱柱分离效果较好。有研究[50]认为，维生素D具有抗恶性黑色素瘤的作用，但也有研究表明[51]，维生素D3化合物还能影响黑色素细胞成熟和分化，甚至促进黑色素瘤形成。因此，对化妆品中维生素D的检测对保护消费者健康具有积极的意义。

3 临床研究

目前公认的正常血清25-羟维生素D［通常以25-（OH）D 表示］浓度被定义为＞20 ng·mL-1（50 nmol·L-1），低于此浓度即为缺乏，＞200 ng·mL-1（500 nmol·L-1）被认为是毒性浓度[4，52]。 有严重缺乏者体内 25-（OH）D浓度会低于 5 ng·mL-1。临床上检测血清中25-（OH）D会选用检测灵敏度更高的免疫法和液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）。

选择免疫法是按照试剂盒生产企业提供的操作说明书来使用的；选择液相色谱-串联质谱法则需要对样品前处理方法、液相色谱条件以及定量离子的选择等一系列条件进行选择与优化。Higashi T等[3]与 van den Ouweland JM等[53]对采用LC-MS/MS法测定维生素D及其代谢物的各种实验条件进行了综述，样品前处理方法有液液萃取（萃取溶剂有乙酸乙酯、正己烷、二氯甲烷或混合溶剂）、离线SPE小柱净化富集、在线柱切换净化、衍生化后离线SPE小柱净化富集、IDS（Iduronate-2-Sulfatase，艾杜糖-2-硫酸酯酶）抗体免疫提取（immuno extraction with IDS antibody）等，离子化方式有ESI与APCI两种，定量方式一般采用内标法。

有不少学者对各种免疫法之间以及免疫法与LC-MS/MS法的检测结果作过对比，赵蓓蓓等[54]对英国维生素D定量保障机构 （Vitamin D External Quality Assessment Scheme，DEQAS）组织的实验室比对报告进行了汇总与分析，DEQAS报告中信息显示来自53个国家、超过2 100家实验室参加25-（OH）D的室间质评项目，参与的检测方法种类超过26种。其中在上报参与评估的检测方法中，数量最多的4种方法依次是：DiaSorin Liaison Total（CLIA 法）、IDS-iSYS（CLIA 法）、LC-MS/MS 法、Roche Total（CLIA 法）。使用 LCMS/MS法的参评实验室超过150家，而且使用LC-MS/MS法参评的实验室有逐年增加的趋势。

张弘等[55]对化学发光法与酶联免疫法检测25-（OH）D的一致性进行了研究，结果两种方法相关性良好，但两组结果的预期偏差大于预设的允许误差，检测结果不一致。

武姗姗[56]对国内 3种检测 25-（OH）D的方法（LC-MS/MS、ECLIA以及ELISA）进行了评估，比较它们同时测定同批血清25-（OH）D的差异性、一致性。结果当血清总25-（OH）D浓度在一定范围内，且25-（OH）D2含量极低时，ECLIA、LC-MS/MS、ELISA测定血清25-（OH）D具有高度正向相关性，结合箱式图、直线回归方程、一致性检验分析，ECLIA所测血清25-（OH）D水平与LC-MS/MS、ELISA具有一定差异性，而LC-MS/MS、ELISA差异性小、一致性佳。

有文献报道了[53]各种免疫法测定维生素D及维生素D体内代谢物的交叉反应性，结果显示，免疫法确实只适用于测定血清中羟基维生素D总量。具体数据见表2。

表2 免疫法测定维生素D及维生素D体内代谢物的交叉反应性

目前临床上主要以免疫法作为测定手段；尤其化学发光免疫分析法，无放射性污染，国内较广泛使用该方法。表3汇总了近年来维生素D测定在临床研究中的一些应用。

从表3数据中看出，不同实验室测定的不同地区人群体内维生素D水平是不同的，这里有实验误差，也有人种差异。所以对于疾病诊断，各个医院还是应该建立自己的正常人群体内维生素D水平的参考值，才能够作出准确的判断。Pudowski P等[73]介绍了中欧地区推荐的体内维生素D水平判断标准，具体如下：①缺乏（deficiency）：＜20 ng·mL-1（50 nmol·L-1）；②略微不足（suboptimal）：20ng·mL-1（50nmol·L-1）～30ng·mL-1（75 nmol·L-1）；③充足（adequate）：＞30 ng·mL-1（75 nmol·L-1）～50 ng·mL-1（125nmol·L-1）； ④高补充 （high Vitamin D supply）：＞50 ng·mL-1（125 nmol·L-1）～100 ng·mL-1（250 nmol·L-1）； ⑤危险 （risky）：＞100ng·mL-1（250 nmol·L-1）； ⑥毒性（toxic）：＞200ng·mL-1（500nmol·L-1）

国内外临床研究科学家建议[73]以下人群要进行血25-（OH）D水平筛查：①特殊人群，包括妊娠和哺乳期女性，有跌倒史和/或有非创伤性骨折史的老年人，缺乏日照的人群，肥胖儿童和成人，接受减重手术的人。②具有佝偻症、骨软化症、骨质疏松症、甲状旁腺功能亢进症、慢性肾脏病、肝功能衰竭、小肠吸收不良综合征、急/慢性腹泻、脂肪泻、胰腺囊性纤维化、炎性反应性肠病、放射性肠炎、淋巴瘤、形成肉肿芽的患者。③使用了抗癫痫药物、糖皮质激素、抗结核药物、唑类抗真菌药以及某些调脂药物的人群。因此可以预见，今后维生素D检测在临床研究上的运用会更加广泛。

表3 维生素D测定法在临床研究中的应用

4 小 结

药品、食品、饲料和化妆品中维生素D的法定检验方法多是采用HPLC法，这是针对体外测定；而对于体内检测，由于正常血清中25-羟维生素D（25-（OH）D）的浓度水平较低，有些严重缺乏者体内25-（OH）D浓度甚至会低于5 ng·mL-1，故检测血清中25-（OH）D及其代谢物的首选检测方式就不再是HPLC法，而是选用灵敏度更高的免疫法和液相色谱-质谱法（HPLC-MS/MS）。通常可以根据检测的目的、样品的来源以及其中维生素D的含量水平，从而选择不同的方法。

从体内检测应用看，由于免疫法具有更高的检测通量，更短的检测周期，操作简便等优点，是目前临床上主要的测定手段，它适合于基层单位。但免疫法也存在只能测定血清中羟基维生素 D 的总量、不能区分 25（OH）D2和 25（OH）D3，且易发生交叉污染和灵敏度较差等缺点。还有，同样是免疫法，它们之间在测定结果上也存在着一定的差异，特别是当血清中25（OH）D2含量极低时，用ECLIA法所测得血清中25（OH）D的水平就与用ELISA法存在一定差异；再如，同是免疫学方法的Roche法和Siemens法在检测不同样本基质之间的差异时，偏倚往往在-60%～30%不等，且没有规律可循。因此，灵敏度、准确度和特异性都很高，尤其是采用同位素稀释的LC-MS/MS法被公认为测定血清25（OH）D的金标准，室间比对报告显示[54]，该法的结果偏倚在-10%～15%波动，而大部分的免疫学方法的结果偏倚在-30%～40%波动，反映出色谱或质谱法的变异性明显优于免疫学方法。但LCMS/MS法会受限于仪器昂贵、较难普及、前处理操作繁琐、对操作人员要求较高等情况，难以在广大基层开展。色谱法或与质谱联用法和免疫学方法哪一种更有优势，不能绝对比较，采用哪种检测方法应该根据各自的检测目的和现有条件来选择。

随着维生素D检测技术的不断发展与创新，通过对这类产品的质量检测和临床治疗药物监测，必将对消费者和患者的健康安全发挥更加积极的作用。