水杨酸盐诱发大鼠听皮层中TNF-α和GluA1表达的改变

李雅兰李婷王采集,葛佳丽肖倩文左健赵泽祺雷冠雄张世丽乔月华,*

1徐州医科大学(江苏221004)

2徐州医科大学形态学研究中心（江苏 221004）

3江苏省人工听觉工程实验室（江苏221004）

4徐州医科大学附属医院（江苏221002）

5湘南学院（湖南423000）

耳鸣(Tinnitus)是在无任何声源刺激情况下对声音的感知。持续性或间歇性的耳鸣影响患者的心情，导致患者入睡困难、注意力无法集中、甚至影响工作和人际关系等问题[1]。目前耳鸣尚无有效的治疗方法，相关的机制尚不清楚。水杨酸盐是目前用来建立动物耳鸣模型的常见药物之一[2]。水杨酸盐诱发耳鸣常伴有不同程度的听力下降，这种听觉剥夺引起听皮层的兴奋活动增强和/或抑制活动减弱导致中枢增益增加，神经元异常活化[3,4]。听皮层过度兴奋可能是耳鸣的主要原因[5-7]，因此听皮层在耳鸣中的研究就显得尤为重要。

研究发现焦虑、心理压力与免疫系统的改变有关[8]。考虑到耳鸣与心理困扰之间的联系，免疫因子在耳鸣中的研究受到关注。放松训练减轻耳鸣患者的焦虑、压力等症状，同时发现血清中肿瘤坏死因子α（TNF-α）降低[9]。水杨酸盐诱导耳鸣动物模型中，听觉中枢中包括TNF-α在内的炎症因子表达增加[10,11]。TNF阻滞剂依那西普显著降低小鼠耳蜗水杨酸盐诱导的耳鸣行为。这些结果提示，神经炎症可能是耳鸣的一种新机制，但其确切作用机理不明[12]。通过调节膜受体的插入和稳态表达水平,TNF-α影响胞膜和胞内的离子通道,从而调节突触传递强度。在这些变化中最突出的改变是胞膜AMPA受体（AMPAR,α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异恶唑丙酸受体）的表达[12,13]。然而，TNF-α在耳鸣中的作用是否通过调节AMPAR表达来实现尚未见研究。因此，本研究采用长期腹腔注射水杨酸盐建立大鼠耳鸣模型，观察动物听皮层中TNF-α和AMPAR的表达变化，初步探讨TNF-α对耳鸣产生的可能机制，以期为耳鸣机制研究提供新思路。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1实验动物

使用健康成年雄性Sprague Dawley大鼠24只，清洁级，由徐州医科大学实验动物中心提供，体重240-260g，耳廓反射灵敏，均无噪声接触及耳毒性药物应用史。随机分笼饲养，将大鼠保持在12/12小时黑暗/光照循环中，不限制饮食和水。本实验过程符合徐州医科大学动物中心动物伦理管理条例规定。

1.1.2实验试剂

水杨酸盐（美国Sigma公司），细胞膜蛋白与细胞浆蛋白提取试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司），BCA测定试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司），兔多克隆抗TNF-α抗体（美国Abcam公司），兔多克隆抗GluA1抗体（美国Millipore公司），鼠单克隆抗β-actin（美国Proteintech公司）

1.2 方法

1.2.1动物分组及模型制备

所有组别的耳鸣模型基于先前的研究[10,14]。24只SD大鼠随机分成4组，每组6只：Ⅰ、对照组（200 mg/kg生理盐水腹腔注射，于上午8时和下午4时各注射一次，连续注射14天）；Ⅱ、慢性注射7天组（200 mg/kg水杨酸盐腹腔注射，于上午8时和下午4时各注射一次，连续注射7天）；Ⅲ、慢性注射14天组（200 mg/kg水杨酸盐腹腔注射，于上午8时和下午4时各注射一次，连续注射14天）；Ⅳ、停药后恢复14天组（慢性注射水杨酸盐14天后再停止注射恢复14天）。所有组别的大鼠分别于造模成功后的第二天上午8时处死。

1.2.2 惊跳反射抑制（PPI）

耳鸣检测参照以往研究[15]。耳鸣检测在声衰减室中进行。动物感知到耳鸣后，我们采用脉冲前抑制-惊跳反射的方法筛选耳鸣大鼠。测量不同时间注射水杨酸或生理盐水的大鼠前脉冲惊跳刺激的PPI值，进行组间比较。

每次实验中，将大鼠固定在装有压力感受器的平台上，实验前先置于65dB SPL白色背景噪声中适应。测试期间，首先随机给予大鼠10次115dB SPL的脉冲刺激，随后，通过扬声器随机给予30次声刺激（10次115dB SPL脉冲刺激、10次没有前声的惊跳反射刺激、10次前脉冲惊跳反射刺激）。惊跳刺激的时间间隔为27-32秒。PPI值为惊跳反射最大幅值减少百分比[（1-PPI/ASR）×100%]。根据公式 PPI（%）=1-（ASR-PPI）/ASR*100%，计算前脉冲抑制率。

1.2.3 Western Blot

每组6只大鼠用4%戊巴比妥那（50mg/kg）麻醉后，断头取脑迅速分离出听皮层。将20%的组织置于蛋白酶抑制剂和裂解液中匀浆，冰上裂解30 min，4℃ 12000g离心30 min，收集上清，即为总蛋白。将膜蛋白抽提试剂A加入剩余组织中匀浆，冰上裂解20min，4℃ 700g离心10 min，收集上清；上清继续4℃14000g离心30 min，吸取上清，即为细胞浆蛋白；将沉淀下来的细胞膜碎片继续4℃14000g离心5 min，吸尽上清。加入膜蛋白抽提试剂B，震荡5s，冰浴10min，同样操作重复3次。随后，4℃14000g离心10 min，收集的上清即为细胞膜蛋白。使用BCA测定试剂盒测定每个样品的蛋白浓度。将提取的总蛋白或膜蛋白样品加入到预制的8%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离GluA1蛋白质(膜蛋白)，12%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离TNF-α蛋白质（总蛋白）。电泳结束后，用硝化纤维素膜进行转膜。5%脱脂奶粉室温封闭印迹膜2小时，4℃孵育兔多克隆抗TNF-α（1：1000）、兔多克隆抗GluA1（1：800）和鼠单克隆抗β-actin（1：5000），摇床过夜。第二天，TBST洗涤3次后，加入一抗种属特异性荧光标记二抗(1：150)室温下孵育2小时。TBST洗涤3次后，通过Odyssey红外成像系统（美国Li-COR公司）扫描蛋白条带。

1.3 数据分析

采用SPSS16.0统计学软件对数据进行分析，组间均数差异性比较使用单因素方差分析（Dunnett事后检验）。TNF-α与GluA1的蛋白表达采用Pearson相关分析。计量资料以均数±标准差（xi s）表示，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 水杨酸盐成功诱导了大鼠耳鸣样行为

本实验采用了听觉惊跳反射来检测动物的耳鸣样行为。惊跳反射是骨骼肌对意想不到的强烈声刺激的反射性收缩。惊跳刺激之前给予弱的声刺激或前脉冲刺激时，动物的惊跳反射幅度被减弱，这种现象为前脉冲抑制(PPI)，通过分析惊跳反射的幅度抑制程度来对耳鸣发生进行评估。本实验所用的PPI程序是：在给予惊跳反射刺激前，发放三种不同强度的前脉冲惊跳刺激75 dB SPL、80 dB SPL和 85dB SPL（分别为 PPI 2，PPI 4和 PPI 8）,并测量每种强度的前脉冲惊跳刺激所对应惊跳反射的抑制程度。根据公式，计算出前脉冲抑制率。不同组别水杨酸盐注射大鼠的PPI值（xi s）（图1、表1）。与对照组、停药后恢复14天组相比，慢性注射7天组，PPI2、PPI4和PPI8均显著升高（F=14.278，P=0.002,P＜0.01；F=12.343，P=0.002，P＜0.01；F=5.962，P=0.014，P＜0.05）；慢性注射14天组较对照组、停药后恢复14天组，PPI2、PPI4和PPI8均 显 著 升 高（F=14.278，P=0.000，P＜0.001；F=12.343，P=0.000，P＜0.001；F=5.962，P=0.002，P＜0.01；）；在对照组、停药恢复14天组中，PPI2、PPI4和PPI8无显著差异（F=14.278，P=0.175，P＞0.05；F=12.343，P=0.706，P＞0.05；F=5.962，P=0.582，P＞0.05）。前脉冲抑制率越大，惊跳反射被抑制的幅度越小。注射水杨酸盐后动物已耳鸣，耳鸣填补了背景噪声的间隔，从而减小了前抑制作用。

图1水杨酸盐对前脉冲抑制率的影响。A慢性注射7天组大鼠的PPI反应测定；B慢性注射14天组大鼠的PPI反应测定；C停药后恢复14天组大鼠的PPI反应测定；数值用均数±标准差表示；前脉冲刺激：PPI2：75dB SPL；PPI4:80dB SPL；PPI8：85dB SPL(*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001)Fig.1 Effect of salicylate on pre-pulse inhibition.A The PPI value measured in rats in the chronic(S7)group.B The PPI value measured in rats in the chronic(S14)group.C The PPI value measured in rats in the recovery(S14+R14)group.Results are expressed as mean±SD.Prepulse stimuli:PPI2,75dB SPL;PPI4,80dB SPL;PPI8,85dB SPL(*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001,respectively)

2.2 TNF-α在听皮层中的表达

慢性注射7天组、慢性注射14天组与对照组、停药后恢复14天组相比，TNF-α蛋白表达显著上升（F=5.381，0.727±0.241，P=0.036，P＜0.05；0.820±0.283，P=0.003，P＜0.01）；慢性注射7天组与慢性注射14天组、对照组与停药后恢复14天组的差异均无统计学意义（P=0.496，P=0.699，P＞0.05）。（图2）

图2各组大鼠听皮层均有TNF-α蛋白的表达。慢性注射7天组、慢性注射14天组与对照组、停药后恢复14天组相比，TNF-α蛋白表达上升（P=0.036，*P＜0.05；P=0.003，**P＜0.01）(n=6)；对照组、停药后恢复14天组，TNF-α蛋白表达无明显变化（P=0.699，P＞0.05）(n=6)。Fig.2 Expression of TNF-α was evaluated using western Blot in the auditory cortex.The expression of TNF-α were markedly increased in chronic treatment groups(S7,S14)compared with control group and recovery group(S14+R14)（P=0.036,*P<0.05;P=0.003,**P<0.01,respectively)(n=6).There was no significant difference in TNF-α protein expression between control group and recovery group（P=0.699,P>0.05）(n=6).

2.3 GluA1膜蛋白在听皮层中的表达

使用亚单位特异性抗体，通过Western免疫印迹显示GluA1蛋白的表达模式（图3）。慢性注射7天组与对照组相比，GluA1膜蛋白表达显著升高（F=7.602，0.529±0.139，P=0.019，P＜0.05）；与对照组、停药后恢复14天组相比，慢性注射14天组GluA1膜蛋白表达显著升高（F=7.602，0.730±0.222，P=0.002，P＜0.01）。慢性注射7天组与慢性注射14天组、对照组与停药后恢复14天组的差异均无统计学意义（P=0.079，P=0.398，P＞0.05）。

图3各组大鼠听皮层均有GluA1蛋白的表达。慢性注射7天组与对照组相比，GluA1膜蛋白表达上升（P=0.019，*P＜0.05）(n=6)；慢性注射14天组与对照组、停药后恢复14天组相比，GluA1膜蛋白表达上升（P=0.002，**P＜0.01）(n=6)；对照组、停药后恢复14天组的差异无统计学意义（P=0.398，P＞0.05）(n=6)。Fig.3 Expression of GluA1 in the auditory cortex.Compared with control group,membrane expression of GluA1 in the chronic treatment(S7)group was significantly increased（P=0.019,*P<0.05）(n=6).Membrane expression of GluA1 was significantly upper in the chronic treatment(S14)group compared to the control and recovery group(S14+R14)（P=0.002,**P<0.01）(n=6).There was no significant difference in GluA1 membrane protein expression between control group and recovery group（P=0.398,P>0.05）(n=6).

2.4 TNF-α与GluA1蛋白在听皮层中的相关性分析

散点图显示的是在每个样本中的TNF-α蛋白与GluA1膜蛋白的水平（图4）

表1 行为测量：不同组别间PPI值比较Table 1 Behavioral testing：Comparisons of PPI values among four groups

图4大鼠听皮层TNF-α与GluA1蛋白的相关性注：TNF-α蛋白的表达与GluA1膜蛋白的表达在听皮层中成正相关，且有显著的统计学差异（r=0.710，P=0.000，***P＜0.001）。Fig.4 Correlation between the protein expression of TNF-α and GluA1 in the auditory cortex in rats Note:There was a significantly positive correlation between the protein expression levels of TNF-α and GluA1 in the auditory cortex（r=0.710,P=0.000,***P<0.001）.

3 讨论

大剂量水杨酸盐会使人和动物产生强烈的耳鸣感。PPI抑制率增高是动物耳鸣的表现[15]。PPI检测反映了听觉信息的快速处理过程受到高级认知中枢的调节[16]。通过与对照组相比，水杨酸盐连续注射7天、14天组大鼠的PPI抑制率显著增高，说明大鼠感知到耳鸣。但在水杨酸盐停止注射恢复14天后大鼠PPI抑制率无明显变化，大鼠耳鸣消失。

当中枢神经系统受到内源或外源性刺激时，星形胶质细胞、小胶质细胞和神经元中会产生TNF-α，TNF-α被视作是耳鸣及情绪状态的分子标志[9,17]。在耳鸣大鼠的中枢听觉神经系统里发现TNF-α基因表达呈可逆性增加[10,11]。在本实验中，与对照组相比，长期注射水杨酸盐诱导耳鸣大鼠听皮层中TNF-α表达显著升高；对照组、停药后恢复14天组，TNF-α的表达无显著差异。此结果与之前的研究结果一致。TNF-α作为一种有效的促炎症分子，改变神经元递质的释放,调节离子通道的表达，使神经元转变为兴奋增加和抑制减少，进一步影响神经可塑性[18]。听皮层过度兴奋是耳鸣的感知基础，因此TNF-α可能参与听皮层的过度活跃导致耳鸣产生[10]。

离子型谷氨酸受体AMPAR位于脑中绝大多数谷氨酸能突触上，介导大部分兴奋性信号传递。AMPAR是同型或异型四聚体复合物，包含四种相似的GluA1-4亚基组合[19]。在神经元活动过程中,TNF-α通过调节表面AMPAR的表达来影响突触传递强度，并可能导致兴奋毒性[20]。海马神经元中，TNF-α应用可使含GluA1亚基的AMPAR表面表达量增加60%，而这些表面表达的变化伴随着AMPAR介导的兴奋性突触后电流的显著增加[21]。在本次免疫印迹实验中发现，长期水杨酸盐应用的耳鸣大鼠听皮层中GluA1膜蛋白的表达水平显著增加。膜蛋白GluA1的增加提示GluA1的过表达使插入突触的同源GluA1/1受体增多，更多的AMPAR向可通透Ca2+的受体转变，Ca2+可渗透的AMPAR（CP-AMPAR）表现出明显的快速动力学和显著的多胺敏感性而呈现出内向整流，AMPAR发生钙内流增强了兴奋性信号的传递。

先前的研究发现，TNF-α作用于肿瘤坏死因子受体1（TNFR1）后引起一系列的信号改变，从而影响AMPAR的表达导致突触强度的变化[13]。TNF-α作用于神经元TNFR1，通过磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）依赖性过程促进AMPAR的胞吐作用，改变了突触AMPAR的分子化学计量，使得微型兴奋性突触后电流（mEPSC）的幅度和平均频率增加，兴奋性突触信号传递增加[22]。TNFR1的激活对于TNF-α诱导AMPAR表面表达的增加是充分且必要的。使用各种蛋白激酶抑制剂以及COX的实验表明，在TNFR1受体的下游，AMPAR表面表达增加需要PI3K活性[21]。Hwang等人发现，在小鼠耳蜗注射300mg/kg水杨酸盐后，TNFR1的mRNA表达增加[12]。结合本实验中，长期水杨酸盐注射后听皮层中TNF-α和AMPAR的表达均增加，而且在时相上两者有很强的相关性，故我们推测TNF-α可能通过作用于TNFR1，激活下游PI3K途径，导致胞膜AMPAR插入增多，最终使得表面AMPAR增加，兴奋性信号增强，参与耳鸣大鼠听皮层的过度活化。

总之，长期水杨酸盐应用导致大鼠耳鸣，这与听皮层中炎症因子TNF-α和兴奋性受体AMPAR表达增多有关。然而，在水杨酸盐诱导的动物耳鸣中，TNF-α表达与AMPAR变化之间的确切信号通路过程还需要进一步的研究来证实。