HPLC法分析不同年限及不同部位掌叶大黄9种成分的积累特征

李 欢，黑小斌，李依民*，刘志军，张海英，高 静，颜永刚，张 岗*

1陕西中医药大学药学院 陕西省秦岭中草药应用开发工程技术研究中心，西安 712046；2 陇县大兴中药材种植专业合作社；3 陇县市场监管局，陇县 721200

中药大黄为蓼科多年生高大草本植物掌叶大黄RheumpalmatumL.，唐古特大黄R.tanguticumMaxim.ex Balf.或药用大黄R.officinaleBaill.的干燥根及根茎，别名将军、黄良等，性寒、味苦，泻下攻积、清热泻火、凉血解毒、逐瘀通经[1]，临床应用广泛。大黄含有蒽醌类、酚类、鞣质、萘苷类及有机酸等成分[2]，蒽醌类为其主要活性成分，有抗炎、保肝、调节胃肠道及抗肿瘤等药理作用[3-5]。《中国药典》(2015年版)规定大黄含量检测指标为芦荟大黄素、大黄素、大黄酸、大黄酚和大黄素甲醚[1]。

大黄喜冷凉气候，耐寒，忌高温，生于海拔1 200～4 000米山沟或林下，野生资源有限，现多栽培于甘肃、青海、四川和陕西等省区。掌叶大黄栽培面积最广，市场需求量最大，已在分析方法、成分含量、分子鉴定及资源利用等方面开展一定研究。如通过超声辅助双水相提取佐以高效液相色谱法以及结合响应面优化，为大黄蒽醌类成分提供了高效、快速、低成本的分离方法[6]。HPLC分析野生掌叶大黄有效成分含量明显高于栽培品，光照、湿度为影响含量的主要环境因子[7]。不同年限大黄含量测定结果表明，大黄宜选用三年以上生药作为大黄药材来源[8]。叶绿体matK可用于大黄正品与伪品的分子鉴定[9]。另有研究发现掌叶大黄分根和须根中蒽醌类含量明显高于其他部分[10,11]。掌叶大黄叶片生药学及相关含量测定研究为叶片资源有效利用奠定基础[12,13]。但是与掌叶大黄年限以及部位相关的研究仍然较少，因此，对不同年限及部位栽培掌叶大黄成分差异积累及药材质量形成规律的探索成为急需解决的科学问题。本实验将3、4、5年生掌叶大黄分别分为根、根茎、叶片3个部位，进行9种成分的HPLC含量检测，以期为掌叶大黄的品质及资源有效利用提供理论基础。

1 仪器与材料

1.1 仪器

Waters 2695高效液相色谱仪，包括四元超高压溶剂系统、自动进样恒温样品管理器，Waters 2998 PAD检测器，Empower 3色谱工作站(Waters,USA)；GB204型电子分析天平(北京赛多利斯)；KQ-200KED超声波清洗机(江苏昆山)；GZX-9140MBE电热鼓风干燥箱(上海博迅)。

1.2 试剂

对照品没食子酸(批号122811)、番泻苷B(11z15)购自天津西玛科技有限公司；大黄素(110795-200505)、大黄酸(0757-200206)、大黄素甲醚(110758-200610)、大黄酚-8-O-葡萄糖苷(110796-200615)、大黄素-8-O-葡萄糖苷(10756-200110)购自中国食品药品检定研究院。大黄酚(B2038)和芦荟大黄素(B20772)购自上海源叶生物科技有限公司。色谱甲醇购自上海泰坦科技有限公司。娃哈哈纯净水购自杭州娃哈哈集团有限公司。其他试剂均为国产分析纯。

1.3 材料

新鲜掌叶大黄全株于2018年11月采自陇县大兴中药材种植专业合作社大黄种植基地，北纬34°37′27′′、东经106°48′35′′，海拔1 524.3米；经陕西中医药大学张岗教授鉴定为掌叶大黄RheumpalmatumL.。3年生(批号ZY1501-ZY1509)、4年生(ZY1401-ZY1409)、5年生(ZY1301-ZY1309)植株各9批，每批次分别处理为根、根茎、叶片3部分，根和根茎切成薄片，45 ℃恒温干燥，备用。

2 方法和结果

2.1 色谱条件

色谱柱为武本C18(5 μm,4.6 mm×250 mm)色谱柱；流动相由甲醇(A)和0.2%磷酸水(B)组成，梯度洗脱(0～5 min，5%～15% A；5～15 min，15%～30% A；15～25 min，30%～35% A；25～31 min，35%～42% A；31～46 min，42%～53% A；46～66 min，53%～68% A；66～75 min，68%～100% A；75～85 min，100% A)，检测波长260 nm，柱温30 ℃，体积流量1.0 mL/min。进样量为10 μL。在上述色谱条件下分析，理论板数按各个成分计算均不低于5 000，与相邻组分峰的分离度均大于1.5，色谱峰对称因子均在0.95～1.05。典型样品色谱图见图1。

2.2 对照品溶液制备

精密称取没食子酸、番泻苷B、大黄酚-8-O-葡萄糖苷、大黄素-8-O-葡萄糖苷、芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚等对照品适量，分别置于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，得到质量浓度分别为0.224、0.656、0.172、0.234、0.079、0.077、0.028、0.048、0.027 mg/mL的各对照品储备液。分别精密量取各对照品储备液1 mL，置于10 mL容量瓶，甲醇补足至刻度，得到相应质量浓度的混合对照品储备液。4 ℃保存备用。

图1 掌叶大黄中9个化学成分标准品(A)及样品(B)的HPLC色谱图Fig.1 HPLC profiles of mixed reference substances of nine components (A) and R.palmatum L.sample(B)注：1.没食子酸；2.番泻苷B；3.大黄酚-8-O-葡萄糖苷；4.大黄素-8-O-葡萄糖苷； 5.芦荟大黄素；6.大黄酸；7.大黄素；8.大黄酚；9.大黄素甲醚。Note:1.gallic acid;2.senna glycoside B;3.chrysophanol-8-O-glucoside;4.emodin-8-O-glucoside; 5.aloe-emodin;6.rhein;7.emodin;8.chrysophanol;9.physcion.

2.3 供试品溶液制备

参考文献[8]，取大黄干燥样品，粉碎成细粉(过四号筛)，混匀，精密称定1.000 g，置具塞锥形瓶中，精密吸取45.0 mL甲醇，称定质量。超声处理30 min(功率500 W，频率40 kHz)，放至室温，再次称定质量，用甲醇补足减失的质量，10 500 rpm离心12 min，取上清液，过0.22 μm微孔滤膜，待测。

2.4 方法学考察

2.4.1 线性关系考察

精密吸取“2.2”项下混合对照品储备液2、4、6、8、10、15、20 μL测定并记录色谱图。分别以对照品溶液进样量为横坐标(X)，峰面积为纵坐标(Y)，绘制标准曲线，结果表明线性关系良好。线性回归方程、线性范围和相关系数(R2)见表1。

2.4.2 精密度试验

取“2.2”项下混合对照品溶液，连续进样6次，每次进样10 μL，记录没食子酸、番泻苷B、大黄酚-8-O-葡萄糖苷、大黄素-8-O-葡萄糖苷、芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚的峰面积积分值，计算得RSD分别为1.16%、1.58%、0.98%、1.36%、0.75%、1.28%、0.32%、0.88%、0.35%，均小于2.00%，表明仪器精密度良好。

2.4.3 稳定性试验

取3年生根(ZY1503)供试品溶液，分别于制备后的0、2、4、8、12、16、24 h进样10 μL测定，记录色谱峰面积，计算其RSD。没食子酸、番泻苷B、大黄酚-8-O-葡萄糖苷、大黄素-8-O-葡萄糖苷、芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚RSD分别为1.39%、1.73%、1.43%、1.21%、1.95%、1.85%、1.26%、1.11%、1.16%，均小于2.00%，表明供试品溶液在24 h 内稳定。

2.4.4 重复性试验

取3年生根(ZY1503)大黄干燥粉末约1 g，精密称定，共6份，按“2.3”项下方法平行制备供试品溶液，分别进样，测定峰面积，计算各成分质量分数。没食子酸、番泻苷B、大黄酚-8-O-葡萄糖苷、大黄素-8-O-葡萄糖苷、芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚平均质量分数的RSD分别为1.81%、1.25%、1.13%、1.88%、1.32%、1.15%、1.08%、1.39%、1.44%，表明方法的重复性良好。

2.4.5 加样回收率试验

取3年生根(ZY1503)大黄干燥粉末约1 g，精密称定，按“2.3”项下方法平行制备2份供试品溶液，一份加入等体积的甲醇，另一份加入等体积已知质量浓度的对照品混合溶液，分别进样，测定峰面积，计算各成分的加样回收率。没食子酸、番泻苷B、大黄酚-8-O-葡萄糖苷、大黄素-8-O-葡萄糖苷、芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚平均回收率分别为99.70%、98.10%、97.30%、102.10%、103.60%、99.70%、108.20%、101.40%、100.60%。RSD分别为0.58%、1.96%、1.38%、1.74%、0.59%、1.76%、1.46%、0.67%、1.56%，表明方法准确度良好。

表1 9种成分的标准曲线和线性范围Table 1 Regression equations and linear ranges of nine constituents

2.5 样品定量测定

取各待测掌叶大黄干燥粉末样品约1 g，精密称定，平行3份，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，并按“2.1”项下色谱条件进行9种化学成分定量分析，测定各成分峰面积，计算各成分在样品中的质量分数。结果见表2。

表2 大黄样品中9种成分质量分数Table 2 Determination of nine constituents composition in R.palmatum L.

续表2(Continued Tab.2)

部位Parts批号Sample No.质量分数Mass fraction (mg/g)没食子酸Galic acid番泻苷BSenna glycoside B大黄酚-8-O-葡萄糖苷Chrysophanol-8-O-glucoside大黄素-8-O-葡萄糖苷Emodin-8-O-glucoside芦荟大黄素Aloe-emodin大黄酸Rhein大黄素Emodin大黄酚Chrysophanol大黄素甲醚Physcion5年根茎Rhizomes of 5th yearZY13010.0904.7473.6201.8030.4390.1260.2390.1750.188ZY13020.0953.7763.8041.2500.4890.0810.2360.1710.178ZY13030.0495.8322.9161.4750.2500.0880.1750.0760.113ZY13040.0495.3363.2681.5210.1920.0860.1690.0700.132ZY13050.0642.6322.0930.7610.1870.0350.1300.0440.143ZY13060.0692.2361.6090.6150.1670.1070.1660.0540.153ZY13070.0704.3792.3761.9000.2380.1740.3150.0990.290ZY13080.0415.4036.2241.0440.5120.0680.3710.1860.184ZY13090.0414.5675.8070.7450.5320.0610.3740.1850.1785年叶片Leaves of 5th yearZY13010.0753.1090.5161.9640.1500.0110.0050.0050.025ZY13020.0812.9530.5071.0220.2090.0220.0170.0041.434ZY13030.1152.1061.1252.4040.2510.0220.0220.0080.043ZY13040.0732.0751.2161.2800.3380.0270.0240.0040.026ZY13050.1032.8881.4487.1120.1820.0450.0530.0030.029ZY13060.1153.1271.8184.3060.4250.0370.0540.0060.024ZY13070.0993.4570.6104.6440.0860.0090.0110.0040.063ZY13080.0594.3481.0554.4760.1130.0230.0430.0050.026ZY13090.0624.4951.2043.7230.1890.0280.0430.0060.0234年根Roots of 4th yearZY14010.0323.4251.2290.0940.9180.1660.4160.1900.313ZY14020.0393.2071.2390.1790.7590.0570.3830.1730.312ZY14030.0874.4921.0340.1230.6320.209 1.2480.3030.595ZY14040.0664.6310.9920.2310.5910.1871.2570.3010.578ZY14050.0443.4971.4580.4810.5420.1900.2080.0540.127ZY14060.0523.9581.5210.1120.5020.1910.7650.3490.357ZY14070.0473.5001.2240.1090.4510.1620.7580.3280.335ZY14080.0172.8330.9480.3600.5860.1030.2740.0650.190ZY14090.0282.3690.9590.3720.5950.1360.2900.0840.2054年根茎Rhizomes of 4th yearZY14010.0230.8250.6710.4240.3610.0840.1110.0620.109ZY14020.0260.6810.6710.3660.3380.0690.1120.0610.090ZY14030.0580.9800.7760.7660.3510.0820.7430.1050.404ZY14040.0670.8760.6040.6140.3150.1690.8070.1510.483ZY14050.0171.0980.8640.4690.2800.1250.1090.0140.075ZY14060.0340.5530.3720.4560.2660.0940.5440.1760.280ZY14070.0370.6130.3790.4690.2620.0550.5370.1630.281ZY14080.0300.7930.6810.5380.1580.0950.0870.0090.058

续表2(Continued Tab.2)

部位Parts批号Sample No.质量分数Mass fraction (mg/g)没食子酸Galic acid番泻苷BSenna glycoside B大黄酚-8-O-葡萄糖苷Chrysophanol-8-O-glucoside大黄素-8-O-葡萄糖苷Emodin-8-O-glucoside芦荟大黄素Aloe-emodin大黄酸Rhein大黄素Emodin大黄酚Chrysophanol大黄素甲醚PhyscionZY14090.0260.7810.6900.5180.1760.1170.0870.0140.0734年叶片Leaves of 4th yearZY14010.0532.8100.2280.0490.0600.0940.0450.0030.020ZY14020.0542.5740.3670.0370.0290.0760.0450.0040.028ZY14030.0873.2250.8580.3880.0030.1140.0740.0020.010ZY14040.0913.2920.8 430.4450.0080.1060.0720.0030.010ZY14050.0553.3120.9710.4740.1150.1160.0150.0040.025ZY14060.0473.2400.9810.4740.4180.1590.0140.0040.025ZY14070.0685.6981.0890.0320.3110.1720.1150.0140.025ZY14080.0490.2580.3690.1130.2770.0370.0180.0020.013ZY14090.0560.2020.2690.1130.4510.0340.0180.0020.0153年根Roots of 3rd yearZY15010.1071.3931.1760.2970.5170.1070.7040.0070.482ZY15020.0912.0991.8440.2690.4060.1080.2870.0050.445ZY15030.1881.0181.0870.3480.2880.0630.4660.0650.282ZY15040.1971.3461.0500.6210.2130.0640.5310.0630.314ZY15050.0371.8881.1520.7660.1000.0360.5700.0740.273ZY15060.0561.1821.1490.2250.0780.0570.1890.0090.261ZY15070.0591.1141.2080.2910.0720.0500.1870.0050.252ZY15080.0901.3251.3760.7490.1790.0810.0790.0090.518ZY15090.0911.1491.4290.5100.1780.0890.1160.0080.5293年根茎Rhizomes of 3rd yearZY15010.0291.4601.1940.3770.2940.0630.4520.0050.880ZY15020.0221.5271.4080.4620.1530.0790.4500.0050.874ZY15030.0590.6491.6420.7450.0450.0180.2080.0060.161ZY15040.0650.5870.5500.4610.0570.0370.2150.0060.155ZY15050.0230.9910.8790.8290.1050.0550.1020.0020.206ZY15060.0320.8800.9060.7510.1370.0890.1100.0020.195ZY15070.0480.8820.8300.2820.0750.0450.2460.0030.243ZY15080.0441.7262.4330.7210.0420.0460.6310.0030.426ZY15090.0451.4730.9650.6680.0980.0370.6000.0030.4063年叶片Leaves of 3rd yearZY15010.0280.3211.0460.1420.1350.1310.0290.0020.017ZY15020.0380.3030.9310.1270.1260.1090.0300.0020.012ZY15030.0530.3891.0640.7400.0990.0220.0390.0030.028ZY15040.0420.2000.8740.7820.2340.0700.0290.0030.0288ZY15050.0320.2361.0710.8860.2940.0630.0370.0060.033ZY15060.0420.1120.1580.7320.1220.0170.0070.0050.008ZY15070.0350.0970.1510.7780.1680.0330.0100.0030.018ZY15080.0660.7280.2421.5740.0310.1570.0520.0040.023ZY15090.0690.7530.1481.2080.0650.1780.0530.0030.030

含量测定结果表明，大黄9种主要成分在所有待测样品中均能检出，每一样品类型中各成分含量变化不大，同一部位不同年限或同一年限不同部位大黄样品中各成分含量存在差异。利用SPSS对不同年限和不同部位大黄样品各成分含量进行单因素方差分析和多重比较，结果见表3、表4。

同一部位样品在不同年限间的含量呈现动态积累(表3)。根中除没食子酸的含量相对稳定外，其他8种成分的含量均随年限增加而增加两倍左右或者4年含量增加两倍左右(P<0.05)、5年变化不显著；根茎中除了大黄素的含量相对稳定外，其他8种成分的含量均随年限增加而增加或者仅第4年增加(P<0.05)；叶片中大黄酚的含量无显著差异，没食子酸、番泻苷B、大黄酚-8-O-葡萄糖苷、大黄素-8-O-葡萄糖苷、芦荟大黄素的含量随年限增加而增加(P<0.05)，而大黄酸和大黄素的含量4年最高(P<0.05)、5年与3年相当。

表4为同一年限不同部位各成分含量积累变化情况。3年生掌叶大黄没食子酸、番泻苷B、大黄酚-8-O-葡萄糖苷、大黄素、大黄素甲醚的含量次序为根>根茎>叶片(P<0.05)；大黄酚的含量根中最高，根茎与叶片无显著差异且为根的1/10；芦荟大黄素叶片含量与根中相当且均高于根茎(P<0.05)；大黄酸、大黄素-8-O-葡萄糖苷的含量在不同部位中无显著差异。4年生大黄根与叶片中没食子酸、番泻苷B的积累量相当且均高于根茎(P<0.05)；芦荟大黄素、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚的含量次序为根>根茎>叶片(P<0.05)，其中根中大黄酚含量为叶片中的42倍左右，大黄素和大黄素甲醚为叶片中10倍；根中大黄酚-8-O-葡萄糖苷、大黄酸的含量最高，根茎及叶片中的含量相当(P<0.05)；根茎中大黄素-8-O-葡萄糖苷含量高，叶片与根相当。5年生大黄中大黄素-8-O-葡萄糖苷的含量次序为叶片>根茎>根(P<0.05)；叶片中没食子酸含量最高，根与根茎中的含量相当且高于叶片；根与根茎中大黄酚含量相当且高于叶片；其他各成分含量次序均为根>根茎>叶片(P<0.05)。

表3 同一部位不同年限掌叶大黄样品中9种成分含量的比较Table 3 Comparison of nine components’ contents of the same part of R.palmatum L.from different growth years

注：同一因素不同处理间不同小写字母表示差异显著(P<0.05),下同。

Note:Different lower case letters represent significant differences aming the different treatments under the same factor at the 0.05 level;the same as follow.

表4 同一年限不同部位大黄样品9种成分含量的比较Table 4 Comparison of nine components’ contents of the same growth year of R.palmatum L. from different parts

3 讨论

HPLC作为中药质量控制与评价最常用分析手段，被广泛运用于中药材含量分析和指纹图谱研究等。其核心部分为指标性有效成分筛选，从而合理进行中药质量评价。HPLC已在大黄成分含量测定、指纹图谱、道地性及资源化学研究方面广泛应用。本研究在前期建立方法[8]基础上选择没食子酸、番泻苷B、大黄酚-8-O-葡萄糖苷、大黄素-8-O-葡萄糖苷、芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚9种成分；将流动相醋酸水更换为磷酸水，相较之下，磷酸水作为缓冲盐酸性更强，对紫外的响应值更低且为不挥发性酸，能够很好地维持流动相的pH值；改良分析体系具有更好分离效果，其精密度高、准确度好、稳定性强。各批样品中9种成分均能被检测到，保证了大黄质量评价的客观性和真实性。

中药材质量由种质与环境共同作用，选择合适的种源与产地是保证中药材质量的首要环节。研究显示四川地区种植环境可能有利于掌叶大黄游离蒽醌类成分的积累，而甘肃种植环境可能有利于结合蒽醌类、酚酸类和二蒽酮苷类成分的积累[7]。掌叶大黄根、根茎、须根、叶片、种子等不同部位蒽醌类衍生物含量差异较大，游离蒽醌总量地下部分远高于地上部分而结合蒽醌总量与之相反，蒽醌总量地下部分略高于地上部分[10]。此外，不同年限大黄有效成分含量分析表明大黄种植不低于三年[8,14]。基于此，为深入探究掌叶大黄质量形成的本质，本研究将3、4、5年生掌叶大黄分别分为根、根茎、叶片3个部位进行有效成分含量差异比较；结果发现，9种成分中番泻苷B的含量最高，大黄酚-8-O-葡萄糖苷次之，大黄酚含量最低；除没食子酸外，大多数成分的含量随年限增加而增加，但含量差异不尽相同，同一年限大黄根及根茎各成分含量高于叶片，且叶片中结合型蒽醌含量高，这与已有地上部分含量检测结果一致[10,13]，据此推断该基地有利于掌叶大黄二蒽酮苷类以及叶片中结合型蒽醌的积累。

除根及根茎入药外，大黄叶片、叶柄等也含有大量活性成分，占大黄总资源的50%左右，被视为资源开发的良好原料[15]。有研究表明掌叶大黄叶片中大黄素含量大致为根中的5倍，叶柄、叶片中还含有一定量的纤维素、可溶性多糖类及人体所需微量元素等[2,11]。也有研究对掌叶大黄叶片成分进行检测将其开发为减肥剂和治疗褥疮的制剂[16]。本研究结果表明3年生掌叶大黄叶片中大黄素-8-O-葡萄糖苷、芦荟大黄素、大黄酸都与根中相当或者较高。4、5年生掌叶大黄叶片中没食子酸、大黄素-8-O-葡萄糖苷的含量与根中相当或较高，说明该基地产掌叶大黄叶片具有一定的开发价值。

中药材发挥功效的物质基础为其主要有效成分，然而药用部位有效成分积累的生物学本质尚不清楚。本研究选用掌叶大黄生药揭示其9种有效成分在不同部位中差异积累，根、根茎中各成分含量高、叶片中含量较低，与药典规定一致，符合大黄根及根茎为入药部位的认识。掌叶大黄含量测定表明地上部位较规定用药部位结合型蒽醌含量较高，但游离型蒽醌达不到药典规定标准，大黄如何通过生理代谢合成并转运有效成分至药用部位贮藏，将是亟待解决的基础科学问题。课题组在本文工作基础上，进行了大黄转录组学基因表达研究，初步揭示了大黄蒽醌类成分生物合成途径基因表达谱特征[17]，有助于理解掌叶大黄品质形成机理，为高品质道地掌叶大黄的定向培育、质量控制及高效生产提供支撑。