黄芪注射液联合葛根素注射液对2型糖尿病小鼠心肌的保护作用及其机制*

王庆霞， 陈会刚， 孙 晶， 石玉珍， 王殿文△

(1 山东大学第二医院药学部药品调剂科， 山东 济南 250000； 2诸城市妇幼保健院病理产科， 山东 诸城 262200； 3山东大学第二医院临床实验室， 山东 济南 250000)

糖尿病心脏病，包括冠状动脉粥样硬化、心肌病、微血管病变和植物神经功能紊乱所致的心率失常，是糖尿病患者致死的主要因素[1]。研究表明，糖尿病伴随心肌病与2型糖尿病患者发生心力衰竭密切相关，是2型糖尿病患者死亡率升高的原因之一[2]。目前，糖尿病尤其是2型糖尿病发病率逐渐增高，且疗效仍不理想，因此需深入认识糖尿病发病机制，寻找新型2型糖尿病的治疗药物。我国传统医学对糖尿病引起的心脏病变也有一定认识：《诸病源候论》中即有“消渴重，心中疼”的记载；《医砭》中亦有“心火太盛津液耗涸，在上…甚则消及肺脏，在中…甚则消及脾脏，在下…甚则消及肾藏，在外…甚则消及筋骨，四藏皆消，则心自焚而死矣……”的论述。现代中医根据糖尿病心肌病的临床表现将其归属于“消渴”、“胸痹”、“心痛”、“惊悸”和“怔忡”等范畴，其中，“消渴”为本，其病机多为气阴两虚，目前已有许多中药组方成功开发并应用于临床消渴病的治疗，取得良好效果[3]，黄芪和葛根作为益气养阴的常见药对，用于消渴病的治疗亦能取得一定疗效。研究表明黄芪注射液联合葛根素注射液对2型糖尿病动物KKAy小鼠肾脏过强的内质网应激反应有良好的抑制作用[4]，但其机制尚不清楚。研究发现2型糖尿病小鼠心肌组织中存在高活性内质网应激反应(endoplasmic reticulum stress, ERS)[5-7]，提示2型糖尿病伴随的病理学改变如心肌肥厚和纤维化与ERS的激活密切相关。研究表明，ERS通过调控内质网钙平衡以及葡萄糖代谢参与糖尿病心肌病的发生和发展[8]，但ERS信号通路激活与糖尿病心肌病发生的因果关系及意义仍不清楚。本项工作联合黄芪注射液和葛根素注射液治疗2型糖尿病小鼠，探讨其对2型糖尿病小鼠心脏病变发生发展过程中内质网应激通路和caspase通路的激活情况，进一步分析其与内质网应激及细胞凋亡的关系，为临床糖尿病心肌病相关新药的研发与应用提供参考资料。

材 料 和 方 法

1 材料与试剂

1.1 实验动物 SPF级KKAy小鼠，雄性，8～10周龄，体重22～25 g，购自中国医学科学院实验动物研究所[合格证号：KYLL-2017(GJ)A-0028]，适应性饲养7 d，自由饮水和进食。高脂饲料(10%猪油+20%蔗糖+2.5%胆固醇+0.5%胆酸钠+67%基础饲料)购自北京科澳协力饲料有限公司，普通饲料购自中国医学科学院动物中心。

1.2 主要试剂 葛根素注射液(批号：1009056，成都地奥九泓制药厂)；黄芪注射液(批号：1404163，湖南五洲通药业有限责任公司)；无水乙醇和二甲苯购自国药试剂；HE染液购自索莱宝公司；TRIzol购自Invitrogen；反转录试剂盒购自Promega；power sybrgreen购自ABI；引物设计应用Primer5软件设计并交由宝生物工程(大连)有限公司合成；抗葡萄糖调节蛋白78(glucose-regulated protein 78,GRP78)、C/EBP同源蛋白(C/EBP homologusprotein, CHOP)和p53调凋亡调控因子(p53 up-regulated modulator of opoptosis,PUMA)抗体购自Abcam;抗caspase-3、cleaved caspase-3、caspase-9、cleaved caspase-9抗体购自Novus；抗多腺苷二磷酸核糖聚合酶[poly(ADP-ribose) polymerase,PARP]和cleaved PARP抗体购自Cell Signaling Technology；反转录试剂盒和Real-time PCR 试剂盒购自 TaKaRa；BCA蛋白浓度检测试剂盒购自Thermo；其它试剂为国产分析纯。

2 方法

2.1 2型糖尿病动物KKAy小鼠模型的建立 用高脂饲料和普通饲料喂养KKAy小鼠，饲养温度为22～25 ℃，相对湿度控制在50%～60%之间；每日12 h光照维持，昼夜循环，自由进食、饮水。实验鼠的处理遵循国家科学技术委员会1988年颁布的《实验动物管理条例》，并得到我校动物管理委员会的批准。待12周龄时，将随机血糖≥13.9 mmol/L的KKAy小鼠视为糖尿病模型建立成功[9]。

2.2 实验动物分组及给药 实验分为对照(control)组、模型(model)组和治疗(treatment)组，将造模成功的KKAy小鼠(12周龄)随机分为模型组和治疗组，具体分组情况如下：对照组(18只)：给予普通饲料饲喂；模型组(18只)：KKAy小鼠给予高脂饲料饲喂，12周龄起每日给予与治疗组相同剂量的生理盐水(4.3 mL/kg)，腹腔注射;治疗组18只： KKAy小鼠给予高脂饲料，每日腹腔注射黄芪注射液(3.0 mL/kg)和葛根素注射液(1.3 mL/kg)，2种药物先后注射。以上各组动物均为单笼饲养，均自由饮食，饮水，每日换垫料，分别于21、24和28周龄各处死6只。

2.3 采集心肌组织样品 分别于21周龄、24周龄和28周龄时分批处死各组小鼠，用剪刀打开小鼠胸腔，将心脏剪下，以冰生理盐水冲洗残留血液，去除大血管，快速切留心尖组织，保存于液氮罐中备用。

2.4 HE染色法观察心肌的形态变化 经4%多聚甲醛固定的心脏组织常规石蜡制片，进行HE染色，光学显微镜下观察心肌组织病理学变化。

2.5 TUNEL染色法检测心肌细胞凋亡 24周龄处死的小鼠心脏组织经4%甲醛固定、脱水、包埋制备石蜡切片(10 μm)。按照TUNEL试剂盒检测心肌细胞凋亡，于光学显微镜下观察并拍照，以细胞核呈棕褐色为阳性细胞，随机取5个视野，分别记录每个视野中阳性细胞数及细胞总数，计算每个视野的凋亡指数，凋亡指数(%)=凋亡细胞数/细胞总数×100%，求平均值。

2.6 Real-time PCR 采集的心肌组织按照TRIzol试剂说明书提取总RNA，分光光度计测定其吸光度(A)值。按照RT-PCR试剂盒说明书合成cDNA，反应条件为：42 ℃ 1 h；70 ℃ 5 min；4 ℃放置10 min后置于-80 ℃保存。取2 ng cDNA进行real-time PCR反应，引物见表1，反应条件为：95 ℃ 5 min； 95 ℃ 20 s；58 ℃ 30 s；72 ℃ 30 s，35个循环；72 ℃ 10 min。IQ5TMReal-Time PCR Detection System(Bio-Rad)进行real-time PCR数据分析，结果经内参照β-actin校正，各基因相对含量用 2-ΔΔCt表示。

表1 Real-time PCR引物

2.7 Western blot 采集的心肌组织50 μg，加入300 μL RIPA裂解液，超声破碎、15 000 ×g，4 ℃离心10 min，按照BCA试剂盒说明书测定总蛋白浓度。每个样本取30 μg进行SDS-PAGE，将蛋白转移到PVDF膜上，5%脱脂奶粉室温封闭1 h，分别孵育Ⅰ抗(GRP78，CHOP，PUMA，caspase-3，cleaved caspase-3，caspase-9，cleaved caspase-9，PARP，cleaved PARP和β-actin)，4 ℃过夜。洗膜、孵育Ⅱ抗(室温1 h)。ECL显影后扫描，蛋白相对表达量经内参照β-actin校正后经ImageJ软件分析。

3 统计学处理

应用SPSS 17.0软件对实验结果进行统计学分析，结果用均数±标准差(mean±SD)表示，多组间的比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)。以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 HE染色观察心肌形态变化

各周龄对照组小鼠心肌细胞排列致密、整齐，心肌细胞结构完整、清晰，细胞核呈卵圆形，大小一致;随周龄增加，模型组小鼠心脏组织病变逐渐加重;与同周龄模型组相比，治疗组小鼠心肌组织病变减轻，可见轻度肌浆溶解。以24周为例，见图1。

Figure 1. Morphological changes of myocardial tissue were observed using HE staining.

图1 24周龄各组小鼠心肌组织形态学观察

2 TUNEL 染色观察小鼠心肌细胞凋亡

TUNEL染色结果显示，对照组小鼠心肌细胞排列有序，细胞核圆而大，核仁清晰，TUNEL阳性细胞少；与对照组比较，模型组小鼠TUNEL阳性细胞数目显著增多(P<0.01)；与模型组比较，治疗组小鼠心肌细胞 TUNEL 阳性细胞数目显著减少(P<0.01),见图2。

Figure 2. Myocardial apoptosis in type 2 diabetic mice was observed by TUNEL staining. Mean±SD.n=6.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsmodel group.

图2 TUNEL 染色观察2 型糖尿病小鼠心肌细胞凋亡

3 各组小鼠心脏组织中GRP78、 CHOP和PUMA的mRNA表达水平

Real-time PCR结果显示：21周、24周和28周时，模型组小鼠心肌组织中GRP78、CHOP和PUMA mRNA表达水平显著高于对照组(P<0.01)；与模型组比较，治疗组小鼠心肌组织中GRP78，CHOP和PUMA mRNA表达水平显著降低(P<0.05)，但仍高于对照组，差异不显著，见图3。

Figure 3. The expression of GRP18, CHOP and PUMA mRNA in each groups were detected by real-time PCR. Mean±SD.n=6.**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsmodel group.

图3 Real-time PCR检测各组小鼠目的基因mRNA表达

4 各组小鼠心脏组织中GRP78、 CHOP和PUMA 蛋白的表达情况

Western blot结果显示：21周、24周和28周时，模型组小鼠心肌组织中GRP78、CHOP和PUMA 蛋白表达水平显著高于对照组(P<0.01)；与模型组比较，治疗组小鼠心肌组织中GRP78、CHOP和PUMA 蛋白表达水平显著降低(P<0.01)，见图4。

5 联合治疗对2型糖尿病小鼠心肌组织凋亡相关通路的影响

Western blot结果显示，与对照组组比较，模型组小鼠心肌组织中cleaved caspase-3、cleaved caspase-9和cleaved PARP蛋白表达水平显著升高(P<0.01)，而caspase-3、 caspase-9和PARP蛋白表达水平无明显变化；与模型组比较，治疗组小鼠心肌组织中cleaved caspase-3、cleaved caspase-9和cleaved PARP蛋白表达水平显著降低(P<0.05)，见图5。

讨 论

高糖诱导的心肌细胞凋亡是导致糖尿病心肌损伤的重要原因。心肌细胞凋亡增多引起心肌细胞数量的相对减少也是糖尿病心肌损伤发生的重要原因之一[10]。本研究结果显示黄芪注射液联合葛根素注射液治疗能缓减2型糖尿病小鼠心肌损伤病情，表明黄芪注射液联合葛根素注射液联具有心肌保护功能；进一步观察到治疗组小鼠心肌组织中凋亡的细胞明显减少，提示黄芪注射液联合葛根素注射液发挥心肌保护功能至少部分通过抑制2型糖尿病小鼠心肌细胞凋亡而实现。

ERS在糖尿病心脏病变的发生发展过程中起着重要的作用[11]，GRP78、CHOP和PUMA共同调控ERS介导细胞凋亡过程[12-14]。GRP78是ERS发生的标志物[15]，其通过促进蛋白质的正确折叠、协助跨膜转运至内质网腔、降低细胞对Tc细胞的敏感性，抑制细胞凋亡[16-17]。ERS发生后通过激活PERK和ATF4信号通路诱导CHOP表达，抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，促进促凋亡蛋白Bid和PUMA的表达，从而激活细胞线粒体凋亡途径[18]。PUMA在p53诱导的细胞凋亡中发挥重要作用[19]，研究证实PUMA蛋白通过翻译后修饰而易于与Bcl-2家族抗凋亡蛋白结合，进而被蛋白酶体降解而抑制细胞凋亡[20]。本研究结果显示模型组GRP78、CHOP和PUMA mRNA表达水平显著高于对照组，表明模型组发生了ERS；治疗组GRP78、CHOP和PUMA表达的减少表明ERS反应程度减轻；Western blot结果显示，模型组小鼠心肌组织中GRP78、CHOP、PUMA、cleaved PARP蛋白水平显著增高，进一步证实ERS通路被激活；同时caspase通路也被激活(cleaved caspase-3和cleaved caspase-9蛋白水平显著增加)，表明2型糖尿病小鼠心肌细胞凋亡相关通路被激活，心肌细胞凋亡增多；而给予黄芪注射液联合葛根素注射液治疗后，小鼠心肌组织中的caspase通路和PARP通路被抑制，几乎恢复到基础水平，与对照组比较无明显差异，说明黄芪注射液联合葛根素注射液能抑制2型糖尿病小鼠心肌细胞凋亡。

Figure 4. Expression of GRP78, CHOP and PUMA proteins in each group were measured by Western blot. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsmodel group.

图4 Western blot检测各组小鼠心肌组织中目的蛋白表达

Figure 5. Effects of combination therapy on apoptosis-related protein expression in myocardium of type 2 diabetic mice. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group;#P<0.05vsmodel group.

图5 联合治疗对2型糖尿病小鼠心肌组织凋亡相关通路的影响

本研究结果证实在2型糖尿病心脏病变过程中，发生了心肌细胞的病变、细胞凋亡及ERS，其凋亡相关通路caspase和PARP通路被激活。黄芪注射液与葛根素注射液联用可以通过抑制ERS和caspase通路的激活、减少心肌细胞的凋亡，从而减缓2型糖尿病心脏病变。