柠檬酸-超声波复合处理对鲜切马铃薯PPO和POD活性的抑制效果

额日赫木，张 琪，崔 娜，武晋海，宋小青

（山西师范大学食品科学学院，山西临汾 041004）

马铃薯（Solanumtu berosum L.）是世界四大粮食作物之一，是维生素、矿物质、膳食纤维、碳水化合物和必需氨基酸的良好来源[1-2]，而且马铃薯的加工性能好，其加工产品的需求量也日益增加[3-4]。果蔬产品的外观、质地、风味、营养、安全等与鲜切产品的品质有关，而产品外观是影响人们选择消费的主要因素[5]。马铃薯在鲜切加工过程中极易产生酶促褐变现象，这不仅使产品失去原有色泽，而且严重影响食用安全性。马铃薯酶促褐变主要是由于酪氨酸酶 （Polyphenol oxidase，PPO:EC 1.14.18.1） 催化氧化酚类化合物而生成黑色素物质所致[6]。在外界因素的影响下PPO分子活性往往会被激发，而酶活性变化主要取决于活性中心部位的暴露程度，也可能是活性中心某一区域结构改变而导致活性变化。此外，过氧化物酶（Peroxidase，POD） 在氧存在条件下，能迅速氧化酚类化合物，可与PPO协同作用引起马铃薯褐变[7]。

关于鲜切果蔬酶促褐变问题，国内外学者进行了大量的研究和探索，推动了防褐变技术的发展。从控制机理和方法来看，化学、物理和分子生物学方法是抑制酶促褐变的主要手段，其中化学方法的应用较为普遍[7]。柠檬酸（Citric acid，CA） 作为食品添加剂在食品工业中具有广泛的应用基础，它是一种有效的抗褐变剂，可通过酸化机制降低体系pH值抑制PPO活性，防止果蔬产品褐变[8]。近年来，非热物理技术的兴起为果蔬防褐变研究供了新的思路。它不仅有效抑制酶活性，而且改善了热处理对食品营养成分和感官品质造成的不利影响[9-10]。如今人们更加青睐于使用低能耗、低成本、高度环保、高效率的非热物理方法的使用[11]，如超声波（Ultrasonic，US）技术，由于US能抑制腐败微生物的生长，并使多种变质酶失活而维持食品的品质，体现了它的应用价值和商业价值[12]，因而得到了研究者的广泛关注。US技术最早应用于降解高分子化合物的研究中，如降解淀粉使其分子量降低且趋于某一特定范围，同时使淀粉颗粒的粒径减小[13]。US处理可以改善一些蛋白质的物理特性。例如，增加大豆蛋白的表面活性和乳化性等[14]。近年来，US在果蔬防褐变研究中也得到了较好的应用，它对酶的作用机理比较复杂,普遍认为空化作用、热效应和机械作用是促使酶活性变化的原因，其中空化作用尤为关键[15]。研究证明，在不同处理条件下US对酶类活性可产生不同的影响，如适当的频率、功率、时间等可以实现酶活性的降低或灭活[15-18]，这为US技术在鲜切果蔬防褐变领域中的应用提供了依据。

目前，物理和化学相结合的形式已成为抑制鲜切果蔬褐变的热点方法，但遗憾的是，US与CA复合方法的研究还未有报道。因此，试验将利用CA-US复合处理鲜切马铃薯，试图抑制PPO和POD活性，进而减少鲜切马铃薯酶促褐变，以期为果蔬防褐变研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂

马铃薯，冀张8号，购于山西临汾尧丰市场，于4℃下贮藏；邻苯二酚（分析纯），南京化学试剂股份有限公司提供；柠檬酸（食品级），上海宝丰生化有限公司提供；愈创木酚（分析纯），上海源叶生物科技有限公司提供。

1.1.2 主要仪器设备

752型紫外可见分光光度计，上海菁华科技仪器有限公司产品；FS-1200N型超声波处理器，上海生析超声波有限公司产品；H1805R型台式高速冷冻离心机，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司产品；LC-Q01型切片机，佛山市顺德区韩泰电器有限公司产品。

1.2 方法

1.2.1 主要溶液的配制

磷酸缓冲液的配制：称取35.8 g磷酸氢二钠和15.6 g磷酸二氢钠，溶解于不同烧杯中并分别定容至1 000 mL，再将上述溶液混合并测定其pH值，最终得到浓度0.1 mol/L，pH值6.8的磷酸缓冲液。

邻苯二酚溶液的配制：称取0.110 1 g邻苯二酚于烧杯，充分溶解后移入50 mL的容量瓶中定容，得到浓度为0.02 mol/L邻苯二酚溶液（现配现用）。

愈创木酚溶液的配制：称取10.02 g愈创木酚，移入500 mL容量瓶中，加入489.98 g蒸馏水充分溶解并混匀后得到2%愈创木酚溶液（于4℃下贮藏）。

1.2.2 试验设计

鲜切马铃薯的CA-US复合处理，马铃薯经过清洗去皮、切片（厚度为0.3 cm）后，置于装有300 mL CA溶液的烧杯中，放置于超声处理装置（图1）中，按表1进行CA-US复合处理。考查超声时间、超声功率、CA溶液质量分数对鲜切马铃薯PPO和POD活性产生的影响，并筛选出最佳条件。

超声波处理装置见图1，CA-US复合处理条件的设定见表1。

图1 超声波处理装置

表1 CA-US复合处理条件的设定

1.2.3 PPO和POD活性在贮藏期间内的变化

将CA-US复合处理和未处理的鲜切样品置于室温（20℃）下贮藏，考查CA-US复合处理和未处理的马鲜切铃薯PPO和POD活性在贮藏时间内180 min的变化。同时，利用全自动色彩色差仪测定CA-US复合处理和未处理鲜样品在0和180 min时的颜色变化，包括L*值、a*值、b*值、△E值的变化。

1.2.4 PPO和POD活性的测定

提取粗制酶溶液，将马铃薯块茎洗净、切丁，然后称取5 g样品，加入30 mL磷酸缓冲液（pH值6.8）进行研磨，再装入离心管内离心（转速10 000 r/min，时间15 min，温度4℃）即可得到粗制酶溶液。

PP0活性的测定是参照孙程旭等人[19]和Aydin N等人[20]的方法并稍作改动。依次量取2 mL的磷酸缓冲液（pH值6.8）、1 mL的邻苯二酚溶液、1 mL粗制酶溶液加入到10 mL试管中，并在30℃恒温水浴锅中预热5 min。待预热结束后，将反应液迅速移入比色皿中，在波长410 nm处测定其吸光度，每隔30 s读数1次，测定4 min内的吸光度变化。POD活性的测定是参照孙程旭[19]的方法进行测定。（酶活性的定义：以单位毫升酶液，每分钟内吸光度每增加0.001为1个活力单位。）

1.2.5 统计分析

各组循环处理5次，取平均值，采用Excel 2007进行统计分析，利用IBM SPSS 20.0软件进行显著性方差分析，组间比较采用单因素方差分析，以p＜0.05为差异有统计学意义。数据表现形式为平均值±标准偏差。

2 结果与分析

2.1 CA-US复合处理对马铃薯PPO和POD活性的影响

超声时间对鲜切马铃薯片PPO和POD活性的影响见图2。

图2 超声时间对鲜切马铃薯片PPO和POD活性的影响

由图2可知，随着超声时间的延长，鲜切马铃薯PPO和POD活性均呈现先下降后上升的趋势。单一的柠檬酸溶液处理（此时超声功率和时间均为0）时，虽然PPO和POD活性与未处理相比均有降低（p＜0.05），然而可以看出 CA-US复合处理 （2.5～12.5 min）的效果明显优于前者。当超声时间增加至7.5 min时，PPO和POD显示最低活性，即分别为43.94（U） 和3.57（U），这与未处理相比，其PPO和POD活性分别降低了71.4%和86.4%（p＜0.05）。当超声时间达到12.5 min时，其PPO和POD活性均出现了上升趋势，并与7.5 min时相比，其活性差异明显（p＜0.05）。由于连续的超声波场致效应改变了PPO和POD分子结构而提高了其活性，也促使酶活性中心更多地暴露并与底物结合[15，21]。由此可见，过长的超声处理时间反而促使酶活性逐渐上升，而不同的超声处理时间对于PPO和POD活性的影响也是不同的。此外，超声波在α-淀粉酶[21]和木瓜蛋白酶[22-23]等相关研究中也显示，超声处理条件是决定酶活性产生变化的重要因素，在适当的超声处理时间下可以改变酶学活性，并同时取决于酶的种类。

超声功率对鲜切马铃薯片PPO和POD活性的影响见图3。

图3 超声功率对鲜切马铃薯片PPO和POD活性的影响

由图3可知，随着超声功率的增加，鲜切马铃薯PPO和POD活性均呈现先下降后上升的趋势。当超声功率达到360 W时，PPO和POD显示最低活性，即分别为44.9（U） 和3.5（U），这与未处理相比，其PPO和POD活性分别降低了69.7%和86%（p＜0.05）。当超声功率增加至600 W与360 W时，其PPO和POD活性均有不同程度的提高。结果表明，不同的超声功率对PPO和POD活性产生的影响也是不同的，而CA-US复合处理与单一柠檬酸处理（此时超声功率和时间均为0）相比，对PPO和POD活性的抑制效果更佳。不同种类的酶在不同的超声处理条件下，其活性变化是不同的，如木瓜蛋白酶在超声功率为40W时，其活性提高了9%[22]；而POD，ATP酶活性会随着超声功率的持续增加而降低[23]。一般认为酶活性的高低主要与其分子空间结构的合理程度有关，而高强度超声处理样品时会产生瞬态空化作用、热效应、机械作用，酶分子在强大的剪切力和冲击波的作用下，分子高级结构可能被改变[25]，如二级结构的组成变化、结构域的构型、三级结构次级键的断裂、分子形态变化等都可能是酶活性被改变的原因。在超声波的作用下可能增加了马铃薯片与柠檬酸溶液的接触频率，继而使介质环境pH值迅速降低、使柠檬酸螯合酶活性中心金属离子的能力提高，从而使酶活性降低。

柠檬酸溶液质量分数对鲜切马铃薯片PPO和POD活性的影响见图4。

图4 柠檬酸溶液质量分数对鲜切马铃薯片PPO和POD活性的影响

由图4可知，随着柠檬酸溶液（超声介质）质量分数的增加，CA-US复合处理与未处理的鲜切马铃薯，其PPO和POD活性均呈现下降的趋势。而略有不同的是POD活性在0.25%以下时，并未呈现显著差异（p＞0.05）。总体来看，CA-US复合处理与单一的超声波处理（此时柠檬酸质量分数为0） 相比，对其PPO和POD活性的抑制效果更佳。当柠檬酸质量分数增加至1%时，PPO和POD呈现最低活性，而与未处理相比，分别降低了69.2%和77%（p＜0.05）。当柠檬酸质量分数加至1.5%时，其PPO和POD活性与1%时相比，并没呈现显著性差异（p＞0.05），这表明其他条件不变，而柠檬酸质量分数增加至一定值后，其PPO和POD活性趋于稳定。结果证明，CA-US复合处理，能够有效抑制鲜切马铃薯PPO和POD活性。如前所述，这不仅与超声波场致效应有关，而且介质的pH值变化也有助于PPO和POD活性的改变。一般引起酶促褐变的最适宜pH值范围在4～7，因此降低介质中的pH值可以抑制酶的催化活性。如果介质中的pH值在3以下，酶的催化活性几乎可以达到最低值或丧失[26]。另一方面，柠檬酸的3个羧基有较强的鳌合酶活性中心金属离子的能力，从而使酶活性降低。因此，鲜切马铃薯PPO和POD活性的变化，可认为是柠檬酸和超声波协同作用的结果。

2.2 贮藏时间对鲜切马铃薯PPO和POD活性的影响

贮藏时间对鲜切马铃薯片PPO和POD活性的影响见图5。

由图5可知，在贮藏时间0～180 min时，CA-US复合处理与未处理的鲜切马铃薯PPO活性，均呈现先上升而后下降的趋势。当贮藏时间增加至30 min时，与0 min时相比，其PPO活性显著增大（p＜0.05）。贮藏时间超过30 min时，其PPO活性逐渐降低，而增加至180 min时均不再降低而趋于稳定。同时，在贮藏时间0～180 min内，鲜切马铃薯POD活性也呈现先上升而后下降的趋势。在贮藏时间为30 min时，未处理的样品POD活性达到最高值，随后开始逐渐降低，并在120～180 min内趋于稳定。而经CA-US复合处理的样品，其POD活性在贮藏时间为90 min时达到最高值，当增加至150 min时，其活性趋于稳定。总体来看，经过CA-US复合处理的样品，在贮藏时间0～180 min内，其PPO和POD活性均低于未处理样品。

贮藏时间对鲜切马铃薯三刺激值及总色差的影响（20℃） 见表2。

表2 贮藏时间对鲜切马铃薯三刺激值及总色差的影响（20℃）

由表2可知，贮藏时间为180 min时与0 min时相比，未处理的鲜切马铃薯的a*值显著增加（p＜0.05），而经过CA-US复合处理的鲜切马铃薯则显著降低（p＜0.05）。a*值（正值） 越大说明红色指数增加，褐变程度也在增大。同时，未处理的鲜切样品在180 min时与0 min相比，其L*值显著降低（p＜0.05），而CA-US处理的鲜切样品并没有显著变化（p＞0.05）。L*值的减少说明白色指数在减少，样品颜色变深。

综上所述，通过CA-US复合处理，可以有效降低鲜切马铃薯的PPO和POD活性而抑制酶促褐变，从而减少马铃薯在加工过程中的损失，这一结果也已通过贮藏试验得到了证明。

3 结论

研究表明，通过CA-US复合处理，可以有效抑制鲜切马铃薯PPO和POD活性，继而减少马铃薯在加工过程中因酶促褐变造成的损失。相对于单一的化学和物理方法，CA-US复合处理方法对PPO和POD活性的抑制效果更佳，而物理和化学方法的协同作用可能是其酶活性降低的主要原因。通过贮藏试验发现，在贮藏前期马铃薯PPO和POD活性略有升高，而在后期逐渐降低。在贮藏时间内，经CA-US复合处理的样品PPO和POD活性，均低于未处理的样品。这表明，经CA-US复合处理的鲜切马铃薯在贮藏期间不会产生明显的褐变现象，而这一结果已通过贮藏期间的颜色变化得到了证明。在试验中，CA-US复合处理条件的筛选是关键环节，此研究的后续工作中还需进一步优化处理条件，并需要对CA-US复合处理的协同作用进行系统的分析。