MDCK细胞连续传代培养的生长特性研究

窦晓霞，马桂兰，乔自林，王家敏，李 倬*

（1.西北民族大学生物医学研究中心，甘肃 兰州 730030；2.兰州百灵生物技术有限公司，甘肃 兰州 730010；3.甘肃省动物细胞工程技术研究中心，甘肃兰州 730030）

MDCK细胞系是从美国一头母曲架犬的肾脏组织分离培养获得的细胞系，通常该细胞呈上皮样以贴壁方式生长，可连续传代培养。许多研究表明MDCK细胞系可广泛用于多种病毒的扩增和纯化，尤其是对流感病毒的感染效率高、增殖快，且流感病毒不易变异的优点，是目前被公认的最适合流感疫苗生产的细胞系之一[1-4]。传统的流感（禽流感）疫苗是由鸡胚来繁殖病毒的，该技术虽然非常成熟，但它在疫苗需求激增时会出现生产能力不足的问题，特别是在应对流感大流行时或暴发禽流感疫情时连鸡胚供应也存在困难，1995年，WHO就曾推荐使用传代细胞来生产流感疫苗。近几年，围绕MDCK细胞系替代鸡胚用于流感及禽流感病毒的监测、研究及疫苗生产的研究均有了突破，为细胞基质的新型流感疫苗的开发提供了理论和实践支持，MDCK细胞为基质的流感（禽流感）疫苗是大势所趋[5-8]，我国各级政府也很支持基于MDCK细胞的流感（禽流感）疫苗的研究和生产。作者所在单位甘肃省动物细胞工程技术研究中心（西北民族大学）于2014年从ATCC引进了MDCK标准细胞系，扩大培养冻存后进行了复苏和传代培养实验，确定了引进的细胞冻存复苏效果良好，连续传代培养10代生长特性基本稳定，可用于相关课题的研究。

1 材料与方法

1.1 MDCK细胞

（ATCC引进，CCL-34TM，批号：60245139。引进时细胞代次为55代，培养一代后冻存）；DMEM（高糖，Gibco，货号：02-5062EJ，批号：1490890，由兰州百灵生物技术有限公司配制成液体，配制批号：20140719，渗透压319mOsmol/kg）；胎牛血清（FBS，兰州民海生物工程有限公司生产，批号20140417）；胰蛋白酶（Gibco，货号：27250，兰州百灵生物技术有限公司配制成0.25%胰蛋白酶溶液，配制批号：20140425，含EDTA-Na 0.3g/L）；显微镜（OLYMPUS，CKX-41）；CO2培养箱（ThermoFisher，3111）等。

1.2 细胞复苏及活力测定

按常规方法复苏MDCK细胞（P56），检查细胞活力达到90%以上时，用10%FBS（体积百分比，下同）的DMEM培养基培养（37℃、5%CO2，下同）。

1.3 连续传代培养

待细胞生长至90%以上融合时，用0.25%胰蛋白酶消化细胞，按1:4比例分瓶培养，连续传代10代（P66）。

1.4 细胞生长曲线绘制

在P57、P59、P62和P66代绘制细胞生长曲线。

1.4.1 细胞悬液的制备 取长成单层的待测细胞，用常规细胞消化方法进行消化，制成细胞悬液，计数。

1.4.2 稀释 根据计数结果，按有限稀释法的原则，将细胞悬液稀释至1×104个/ml。

1.4.3 接种及培养 将稀释好的细胞悬液接种到24孔细胞培养板培养，每孔1 ml。

1.4.4 计数及活力检查 从接种培养起，每隔24 h，分别消化3孔的细胞进行计数。

1.4.5 生长曲线绘制 以培养时间为横坐标，细胞密度为纵坐标，绘制细胞的生长曲线图。

1.5 细胞倍增时间计算

取细胞增长峰值前一次（96 h）所计得的细胞总数(Y)，接种细胞数（X）及生长时间（T）计算：倍增时间=T/A （式中：A=log2Y/X）。

1.6 细胞最大增殖浓度

细胞生长曲线的峰值即为细胞最大增殖浓度，P57代细胞在144 h细胞密度还未见降低，统计时按144 h的细胞密度为最大增殖浓度。

2 结果

冻存的MDCK复苏活力为95.3%。MDCK细胞复苏后第一代培养细胞生长较慢，可能细胞刚复活有适应的过程，传代一次后生长变快，按1:4分瓶子比例培养时，在48h就形成较致密单层，连续传代培养10代细胞形态基本一致，如图1。

图1.MDCK细胞形态图(48h,10X)（a.P57,b.P59,c.P62,d.P66）

P57生长曲线在48-144 h近直线，144 h细胞密度为107.6×104个/ml，还未出现下降的情况，倍增时间为15.8 h。P59、P62和P66细胞生长曲线成近“S”曲线，最达峰值均出现在120 h，分别105.5×104、97×104和102.4×104（个/ml），倍增时间分别为15、15.2和15.3（h），见图2。

图2.MDCK细胞生长曲线图

3 结论

随着生物制药的快速发展，对生产用细胞系的要求越来越严格，标准细胞库建设就显得尤其重要。ATCC是全球规模最大管理最规范和最有权威的细胞保藏机构之一，为全世界的科研工作有偿许可的提供标准细胞株。每次从国外引进细胞株的成本很高，引进后首要的工作就是要进行保种，为后期工作提供最原始的细胞种子。作者所在单位于2014年从ATCC引进了MDCK细胞系，通过复苏和连续传代验证了保种的效果，初步证实了引进和保种的细胞是可靠的。当然， 确定一株细胞能否用于疫苗方面的研究，还要建立可持续使用数量足以维持数年或数十年工作所需的主细胞库和工作细胞库，生产用的还要确定超高代次，要进行更全面的细胞检定，有的甚至送第三方机构进行，检定的内容主要包括遗传特征、外源因子污染和致瘤性等方面，随着研究工作的深入开展，这也是今后工作的重点。[9]