产酒精热带假丝酵母突变株的五、六碳糖共代谢分析

杨 薇,王巧云,邓永东,吴学凤,王华林,郑 志,李兴江,*

(1.天津农学院,天津 300384; 2.合肥工业大学食品与生物工程学院,安徽合肥 230009)

长期以来,谷物粮食一直都是乙醇生产的主要原料,而随着人口的增长和可利用资源的减少,寻找清洁可再生的新能源-生物质乙醇受到了广泛关注[1]。同时,农作物秸秆、木材、林业加工废料和废弃纸品等是主要的废弃生物质原料,每年大量的生物质原料由于得不到充分利用而被舍弃。富含纤维素和半纤维素的生物质是最有潜力的乙醇生产原料,其组成一般为:纤维素32%～41%,半纤维素36%～47%,木质素14%～26%[2],并且纤维素原料是地球上最丰富、最廉价的可再生资源。因此,利用纤维素水解制糖,进而生物转化生产乙醇具有重要意义。

纤维素的主要水解产物是六碳糖(以葡萄糖为主)及五碳糖(以木糖为主)等,对葡萄糖和木糖的有效利用是生物转化生产乙醇的关键节点之一。葡萄糖是一种容易利用的碳源,大多数微生物都可以利用葡萄糖发酵生产乙醇,而大多数微生物对木糖的利用率很低。研究报道,在利用木糖发酵的微生物中,发酵能力最强的是酵母,能够利用戊糖发酵的三种酵母分别为管囊酵母(Pachysolentannophilus)、逻辑树干毕赤酵母(Pichiastipitis)和热带假丝酵母(Candidatropicalis),充分利用纤维质原料中的木糖,可使酒精的产量在原有基础上增加25%甚至更高[3-4]。目前,研究主要涉及的是管囊酵母和逻辑树干毕赤酵母五、六碳糖共发酵菌种的选育,管囊酵母、逻辑树干毕赤酵母对酒精和抑制剂耐受度低,限制了其在工业上的应用[5],并且关于共发酵代谢分析方面目前也鲜有研究。

因此,本研究采用紫外诱变法对热假丝酵母进行选育,通过色谱法研究代谢通量,对其共发酵产酒精代谢分析开展研究,以期为工业上纤维素废弃原料的有效利用提供有效参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

热带假丝酵母CICC1779 合肥工业大学农产品加工院保藏;其他试剂 国药集团化学试剂有限公司;斜面培养基(1 L):葡萄糖20 g、酵母粉10 g、蛋白胨20 g、琼脂20 g;液体培养基(1 L):葡萄糖20 g、酵母粉10 g、蛋白胨20 g;TTC 下层培养基(1 L):木糖10 g、蛋白胨2 g、酵母粉1.5 g、磷酸二氢钾1 g、七水硫酸镁0.4 g、琼脂30 g,pH5.5～5.7;TTC 上层培养基(1 L):木糖0.5 g、琼脂1.5 g、TTC 0.05 g;发酵培养基(1 L):葡萄糖30 g、木糖30 g、硫酸铵5 g、磷酸二氢钾1 g、酵母膏1 g、七水硫酸镁1 g。

756MC紫外分光光度计 上海第三分析仪器厂;FE20实验室pH计 梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司;MC酒精计 上海长城仪器厂;WYT-4型手持糖量计 泉州中友光学仪器有限公司;RE-85Z旋转蒸发仪 上海五相仪器仪表有限公司;Waters 2695 高效液相色谱仪 沃特斯科技(上海)有限公司;Agilent 7890A型气相色谱仪 安捷伦科技有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 菌种筛选

1.2.1.1 紫外诱变 将热带假丝酵母CICC1779转移至斜面培养基上,于30 ℃下培养至对数生长期,用生理盐水调节菌液浓度为109CFU/mL。在磁力搅拌器作用下于紫外灯下(20 W、25 cm)分别照射20～80 s[6]。稀释诱变后的菌液并涂布于木糖唯一碳源固体平板上,30 ℃避光培养2 d[7]。然后挑选长势良好的菌株,接种到以浓度为200 g/L的木糖为唯一碳源筛选培养基上培养1～2 d。

1.2.1.2 初筛 配制木糖液体发酵培养基,灭菌(121 ℃,20 min),用移液枪将培养液加到杜氏小管至10 mL,迅速将杜氏小管倒入试管中,在固体培养基中沾取少许菌落,放入试管中搅拌,用封口膜封口,并放入恒温培养箱中培养2 d,观察杜氏小管中的气泡情况[8],选取产气较多的突变株进行复筛。

1.2.1.3 复筛 在木糖固体培养基上培养初筛单菌落,待菌落长出后在其上面倒入TTC(2,3,5-氯化三苯基四氮唑)选择培养基,阴暗处30 ℃恒温培养2 h,观察选择培养基内各个菌落的颜色,挑选出颜色较红的菌落用于后续研究[9]。

1.2.2 生长曲线的测定及种子液的制备 将筛选得到的菌株接种到液体培养基,每隔2 h在波长600 nm下测定其OD值,确定其生长曲线。然后再培养至对数生长期,制备成种子液备用。

1.2.3 发酵工艺 将培养至对数生长期的种子液接种至121 ℃灭菌15 min的液体培养基中发酵,发酵温度设定为34 ℃,初始pH调节到4。发酵96 h[10]。

1.2.4 指标测定方法 糖含量测定采用液相色谱法[11];色谱条件:Waters Carbohydrate Analysis Column(3.9 mm×300 mm)色谱柱;流动相为80%乙腈-20%水,0.22 μm微孔滤膜过滤。超声脱气30 min,进样量为20 μL,流速为1.0 mL/min,柱温为30 ℃。根据外标法定量计算样品中糖含量,葡萄糖标准曲线方程为y=8.67143x-0.00524,R2=0.996,在0～0.1 mg/mL的范围内线性良好;木糖标准曲线方程为y=4.53995x+0.02194,R2=0.993,在0～0.2 mg/mL的范围内线性良好。

乙醇含量的测定采用气相色谱法[12],检测条件:色谱柱为ZB-624,柱温100 ℃(1 min),15 ℃/min,190 ℃(3 min);柱流量为高纯氮30 mL/min(恒流);气体流量为氢气400 mL/min,空气400 mL/min;进样口200 ℃;检测器250 ℃。根据外标法定量计算样品中乙醇含量,乙醇标准曲线方程为y=13.01x-0.223,R2=0.998,在乙醇和正丙醇之比在1∶2的范围内线性良好。

菌体重量采用恒温干燥法测量:将滤纸于105 ℃下烘干至恒重,取100 mL 样品液于6000 r/min离心10 min,去上清液,将沉淀用蒸馏水洗涤2～3次后置于80 ℃烘干至恒重称量,计算菌体干重。

1.2.5 代谢网络构建及流量分析 代谢通量分析是进行计算细胞内代谢产物流量分布的有效分析手段,是在拟稳态的基础上来进行计算的,即假定段时间内中间体的量不变,计算公式为:

r=GTV

其中,向量r为代谢物净形成速率(mmol/(g DW·h)),V为内部反应速率(mmol/(g DW·h))。G为总化学计量矩阵用于所有反应物和反应产物。代谢通过EXCEL 2007的MMULT和MINVERSE进行计算[13]。

1.3 数据处理

根据Design expert 8.0.6.1和Origin 9.0进行数据分析和作图。

2 结果与分析

2.1 突变菌株筛选结果

2.1.1 突变菌株初筛结果 酵母菌产气的时间越早,产气量越多,代表酵母菌的发酵性能越好。在进行酵母菌研究时,应选取产气量较多的酵母菌。表1显示的是突变菌的杜氏小管产气表。由表1可知,在诱变的菌株中,产气泡最多的六种菌株的编号分别是T70-2、T110-1、T30-1、T50-1、T70-3和T90-2。选择这六株产量较高的菌株进行下一步的筛选。

表1 杜氏小管产气结果Table 1 The results of Dushi tube gas production

2.1.2 突变菌株复筛结果 突变菌株的复筛单菌落如图1所示。TTC(2,3,5.氯化三苯基四氮唑)是一种与酵母的代谢产物发生显色反应的显色剂,通过它可以判断酵母呼吸酶活力的大小,间接反映酵母产酒精能力的高低。在培养基上的酵母菌落上覆盖一层TTC显色剂,菌落会显示不同的颜色,产酒精能力强的酵母会显现深红色,次之为粉红色、微红色或不显色[15-16]。从图1中筛选出最红的单菌落(T70-2)作为后面研究的菌株,并将此菌株命名为:热带假丝酵母 CICC1779-T70-2。

图1 TTC显色单菌落图Fig.1 Single colony map of TTC coloration

2.2 原始菌和突变菌生长曲线对比分析

原始菌和突变菌的生长曲线如图2,由图2(A)可知,原始菌株在以葡萄糖为唯一碳源的条件下能较好生长,且呈现良好的S型生长曲线,在13 h附近达到对数生长期,此时菌体生长最为旺盛,在20 h 左右达到最大OD值1.6,随后进入稳定期。但在以木糖为唯一碳源条件下生长缓慢,无明显的对数期,其最大OD值只能达到以葡萄糖为碳源条件下的1/3(0.6),说明相比葡萄糖,原始菌对木糖的适应性较差,在以木糖为唯一碳源条件下不能较好生长。

经过突变筛选得到的菌株其生长曲线如2(B)所示。由图2(B)可知,突变菌株在以葡萄糖为唯一碳源的条件下依旧能较好生长,呈现良好的S型生长曲线。在10 h附近达到对数生长期,相比较原始菌提前了3 h,其最大OD值和原始菌相似,保持在1.6左右。突变菌在以木糖为唯一碳源条件下也能较好生长,在12 h附近进入对数生长期,滞后于以葡萄糖为碳源条件下的时间。其最大OD值约为1.1,相比较原始菌以木糖为碳源条件下有明显提升。

图2 原始菌(A)和突变菌(B)生长曲线Fig.2 Growth curve of the original and mutant strain

2.3 原始菌和突变菌发酵结果对比分析

图3表示原始菌株和突变菌株发酵过程中葡萄糖浓度(a)、木糖浓度(b)、菌体浓度(c)和乙醇浓度(d)的变化情况。由图3(a)可知,葡萄糖浓度整体下降的比较明显,原始菌株和突变菌株对葡萄糖的利用情况都较好,在72 h时利用率利用率分别接近95%、96%。由图3(b)可知,原始菌株和突变菌株对木糖的利用率有明显差别。原始菌株发酵时,木糖的浓度在前24 h下降缓慢,24～72 h下降速度较快,在72 h之后木糖含量趋于稳定,其残糖量接近13.25 g/L,木糖的利用率只能达到55.8%;突变菌株发酵时,木糖浓度整体下降速度较快,木糖在36 h之后也呈现较快下降趋势,72 h木糖浓度仅为5.16 g/L,在84 h左右趋于稳定,其残糖量接近2.32 g/L,木糖的利用率达到92.2%。随着对葡萄糖和木糖的代谢分解,菌体开始大量繁殖,原始菌和突变菌的菌体浓度都开始上升,如图3(c)所示;菌体代谢葡萄糖、木糖,乙醇浓度开始上升,突变菌发酵产生的乙醇浓度在72 h时达到最大浓度22.85 g/L,但由于原始菌对木糖的利用率较低,乙醇产量最终也只有17.58 g/L,说明此突变菌对比原始菌,对木糖的利用转化率有较大提高。

图3 原始菌和突变菌发酵过程中成分浓度变化Fig.3 Variations in the concentration of components of the original and mutant strain during fermentation process

2.4 突变菌共代谢流量分析

图4为酵母菌五、六碳糖的代谢网络和代谢方程,表2给出了各个关键酶中间体的催化过程,表3列出32个节点的流量方程式。其中方程式1～19依据的是代谢体物质的量平衡公式,方程式20～28的系数常量依据参考文献[17-18]。底物输入、产物输出、细胞生成量都是直接检测的。细胞生物量在60～72 h接近平衡,特别选择此时期进行代谢通量分析。整体通量数据有32个未知量对应32个反应式,通过EXCEL 2007矩阵计算得到通量结果,结果如表4所示。

图4 突变菌株代谢网络Fig.4 Metabolic network of mutant strains

表2 突变菌株代谢反应Table 2 Metabolic reactions of mutant strains

续表

表3 突变菌株代谢方程Table 3 Metabolic equation of mutant strain

表4 突变菌株代谢流量数值表(mmol/(g DW·h))Table 4 Metabolic flux values of mutant strains(mmol/(g DW·h))

原始菌株和突变菌株的代谢流量见表4,输入底物与产物通量变化与葡萄糖、木糖的消耗变化以及乙醇产量变化相吻合。由表4可知,突变菌株整体的代谢流量明显高于原始菌株,尤其在几个关键节点木糖的消耗流量明显加快,从J5到J6再到J7、J8的流量增大,说明了突变菌株对木糖的代谢增强,同时丙酮酸流向乙醛的流量也显著增加,J21和J22流量的增大,充分说明了突变菌株有更多的流量流向了乙醇,乙醇产量显著提升。原始菌不能有效代谢木糖,是由于其缺乏木桐糖酶,无法将木糖转化为木糖醇,戊糖磷酸途径无法顺利进行[19]。突变菌对木糖的代谢能力明显增强,主要是由于突变菌株可以提供木桐糖酶,保证了戊糖磷酸途径J5、J6、J7的顺利进行,使突变菌株更能适应木糖环境下的生长和代谢,提高了突变菌株对木糖的利用率,增加了乙醇的产率。本文通过原始菌和突变菌对葡萄糖和木糖代谢的内部流量分析,更加清晰地探究了其发酵过程中各个路径的代谢和流量走向,为以后流量的进一步控制奠定坚实基础。

3 结论

原始酵母菌对木糖的利用率一直较低,大量的生物质原料得不到充分利用造成严重浪费。本文对热带假丝酵母进行诱变筛选,获得一株能利用木糖发酵的菌株:热带假丝酵母 CICC1779-T70-2。通过对原始菌和突变菌发酵成分指标检测对比分析可知,原始菌株对木糖的利用率仅为55.8%,而突变菌株的木糖利用率为92.2%;突变菌发酵产生的乙醇浓度最高可达22.85 g/L,而原始菌乙醇的产量最终只有17.58 g/L。进而对突变菌代谢机理深入研究,构建酵母菌代谢网络并建立方程,对其代谢流量进行分析可知,原始菌不能有效代谢木糖是由于其缺乏木桐糖酶,无法将木糖转化为木糖醇,戊糖磷酸途径无法顺利进行,突变菌可以提供木桐糖酶,保证了戊糖磷酸途径的顺利进行,提高了突变菌株对木糖的利用率,增加了乙醇的产率。本文深入探究分析酵母菌对五碳糖和六碳糖的共代谢,为后续的放大生产奠定了理论基础。