雌激素对奶牛乳腺上皮细胞中酪蛋白和甘油三酯表达的影响

■武开乐 库西塔别克·买买提依不拉音 马 静 邵 伟，2 余 雄，2*

（l.新疆农业大学动物科学学院，新疆乌鲁木齐830052；2.新疆肉乳用草食动物营养重点实验室，新疆乌鲁木齐830052）

奶牛乳腺上皮细胞是激素在奶牛乳腺中的重要反应器，也是研究乳腺的生长发育和泌乳机制的重要体外模型，因此提高乳腺上皮细胞中乳蛋白及乳脂的合成对生产优质乳具有重要的意义。乳腺的发育是在多种激素的共同调节下完成的[1-2]，雌激素主要是通过机体内一些由不同组织分泌的因子，这些因子通过多种分泌途径来发挥对乳腺发育的作用[3]。近年来，对于雌激素在畜牧方面的研究，大多集中在反刍动物上，主要是通过饲喂异黄酮类（isoflavone）、木脂素类（lignans）和香豆雌酚（coumestrogen）这几种结构与动物体内雌激素相类似的物质进行动物实验。特别是通过动物研究雌激素对奶牛的泌乳性能及乳成分的表达研究已经逐渐开展[4-6]，但在细胞水平上对奶牛乳成分的研究却很少报道。本研究通过体外培养奶牛乳腺上皮细胞，研究不同浓度雌激素对其乳成分表达的影响，不仅为雌激素在细胞分子水平上对奶牛乳腺上皮细胞的研究奠定基础，而且可以进一步的为雌激素在提高奶牛的乳成分的表达方面提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验设计

本研究于2018 年2 月至2018 年4 月在新疆肉乳用草食动物营养实验室进行雌激素调控奶牛乳腺上皮细胞酪蛋白和甘油三酯调控的试验。将乳腺上皮细胞复苏后，添加细胞完全培养基，放入37 ℃、5% CO2培养箱培养，选取扩增生长较好的乳腺上皮细胞，分别添加0、50、100、200 μmol/l雌激素孵育BMECs后，在12、24、48、72 h各时间点采用Western Blot方法及高效液相色谱分析法检测各组细胞中α-酪蛋白（CSN1）、β-酪蛋白（CSN2）及甘油三酯（TG）的表达量。

试验分为两组：对照组为单纯乳腺上皮细胞培养组，试验组为不同浓度雌激素添加组。

1.2 主要试验材料及试剂

奶牛乳腺上皮细胞系（华英生物：支原体检测为阴性，STR 鉴定结果：Amelogenin：X；CSF1PO：10，12；D13S317：8，9；D16S539：11，12；D5S818：10，13；D7S820：10，11；THO1：8，9.3 ；TPOX：9，11；vWA：15，17）、CO2恒温培养箱、洁净工作台、生物倒置显微镜、倒置荧光显微镜、离心机、Fresco 低温冷冻离心机（Thermo）、MultiSkan3 酶 标 仪（Thermo）、酸 度 计pH211（Hanna）、高效液相色谱仪（日本岛津2010A）。

MEBM、胎牛血清（Fetal Bovine Serum/FBS）、胰酶、PBS、蛋白抽提试剂（华英生物）、BCA蛋白定量试剂盒（华英生物）、2 mg/ml BSA标准品（华英生物）、5×还原样品缓冲液（华英生物）、考马斯亮蓝染色液（华英生物）、丽春红染色液（华英生物）、BSA（Amresco 0332）、PMSF（Amresco 0754）、APS（Amresco 0486）、Tween-20（Amresco 0777）、Bromphenol Blue（Amresco 0449）、NP-40（Amresco M158）、Trizma base（Sigma T1503）、Glycine（Sigma G8898）、Sodium deoxycholate（Sigma D6750）、蛋白酶抑制剂（Roche 11697498001）、甲 醇（国 药10014118）、璜基水杨酸（国药10021516）、TCA（国药80132618）、氯化钠（国药10019392）、1，2-丙二醇（华英生物）、乙腈（华英生物）、正己烷（华英生物）、苯甲酰氯（华英生物）、异丙醇（华英生物）、三氯醋酸（华英生物）。

1.3 试验方法

1.3.1 细胞的纯化

将液氮罐中购买的细胞，用镊子取出，迅速放在已开启的37 ℃的水浴锅中，不停地在水中晃动，使其在1 min 内融化。之后将其移至超净台内，用移液枪接种至25 cm2（T25）的细胞培养瓶中，加入完全培养基使其再次生长。在37 ℃、5% CO2饱和湿度条件下培养，待细胞融合度达80%时开始进行扩增纯化。

1.3.2 细胞的培养

当细胞融合度达80%左右之后，将旧的培养基弃去，用2～3 ml 磷酸盐缓冲溶液（PBS）洗两遍，加入预热好的0.25%胰蛋白酶1～2 ml进行消化，在培养箱中孵育2～3 min，然后取出来在显微镜下一边观察一边轻微地弹下培养瓶底部，让其细胞脱落。在显微镜下观察到大约70%细胞脱落之后，加入完全培养基终止消化。再用移液枪进行轻微吹打将其余细胞吹打下来。移至离心管中，在2 000 r/min下离心2 min，小心弃去上清液，加入完全培养基并用移液枪打匀，传到细胞培养瓶中，正常情况下3 d可以长满培养瓶内部，在此期间换一次培养基。按照上述的培养方法，将细胞纯化扩增到第3 代，在加入不同浓度的雌激素，然后将所有细胞样进行12、24、48、72 h的培养。

1.4 样品收集

收集对照组及各雌激素浓度添加试验组在12、24、48、72 h各时间点的细胞样品，每组设3个平行，3个重复，取样后将细胞样品先放置于-20 ℃的冰箱中2 h，后取出放置于-80 ℃的冰箱过夜，再将过夜后的细胞样品放入液氮罐中保存。将样品送至北京华英生物技术有限公司检测奶牛乳腺上皮细胞中α-酪蛋白（CSN1）、β-酪蛋白（CSN2）及甘油三酯（TG）的表达量。

1.5 数据处理

所有原始数据先用Excel 2016 进行整理，用SPSS 22.0 软件进行单因素方差分析，并用Duncan's法进行多重比较。数据最终计算资料用“平均值±标准差”表示，以P＜0.05 作为差异显著性判断标准，P＜0.01作为差异极显著判断标准。

2 结果与分析

2.1 观察奶牛乳腺上皮细胞的形态

图1 奶牛乳腺上皮细胞复苏后生长的形态

由图1可以看出，复苏后正常生长的奶牛乳腺上皮细胞成片连接，呈不规则的铺路石状。

2.2 酪蛋白表达量结果

2.2.1 雌激素对CSN1表达的影响

表1 不同雌激素浓度在不同时间段对CSN1表达量的影响（灰度值）

由表1 可知，在12 h 时，与对照组相比，添加50 μmol/l雌激素组其CSN1的表达量极显著高于对照组（P＜0.01）；在24 h时，与对照组相比，添加100 μmol/l雌激素组其CSN1 的表达量显著高于对照组（P＜0.05），添加200 μmol/l 雌激素组其CSN1 的表达量极显著高于对照组（P＜0.01）；在48 h时，与对照组相比，添加100 μmol/l 雌激素组其CSN1的表达量显著低于对照组（P＜0.05）；在72 h 时，与对照组相比，添加50、100、200 μmol/l雌激素组其CSN1的表达量极显著高于对照组（P＜0.01）。其余组与对照组间差异均不显著。

在12 h 时，50 μmol/l 雌激素添加组CSN1 表达量显著高于200 μmol/l 雌激素添加组（P＜0.05），且极显著高于100 μmol/l雌激素添加组（P＜0.01），200 μmol/l雌激素添加组CSN1表达量极显著高于100 μmol/l 雌激素添加组（P＜0.01）；在24 h时，200 μmol/l雌激素添加组CSN1 表达量极显著高于50、100 μmol/l 雌激素添加组（P＜0.01），100 μmol/l雌激素添加组CSN1表达量极显著高于50 μmol/l 雌激素添加组（P＜0.01）；在48 h 时，50、200 μmol/l 雌激素添加组CSN1 表达量显著高于100 μmol/l 雌激素添加组（P＜0.05）；在72 h时，200 μmol/l雌激素添加组CSN1表达量极显著高于50、100 μmol/l 雌激素添加组（P＜0.01）。其余各浓度组间差异均不显著。

不添加雌激素时，对照组CSN1 表达量在48 h 时显著高于其他各时间点（P＜0.05）；添加50 μmol/l雌激素时，12、48、72 h 的CSN1 表达量显著高于24 h（P＜0.05）；添加100、200 μmol/l 雌激素时，24、72 h 的CSN1 表达量显著高于12、48 h（P＜0.05）。其余各时间点差异均不显著。图2 是各组在不同时间段时细胞CSN1 表达的凝胶图像。

图2 不同雌激素浓度在不同时间段时CSN1表达的凝胶图像

2.2.2 雌激素浓度对CSN2表达的影响

由表2 可知，在48 h 时，与对照组相比，添加200 μmol/l 雌激素组其CSN2 表达量显著高于对照组（P＜0.05）；在72 h 时，与对照组相比，添加100 μmol/l雌激素组其CSN2 表达量显著高于对照组（P＜0.05），添加200 μmol/l 雌激素组其CSN2 表达量极显著高于对照组（P＜0.01）。其余组与对照组间差异均不显著。

表2 不同雌激素浓度在不同时间段对CSN2表达量的影响（灰度值）

在12 h 时，100 μmol/l 雌激素添加组CSN2 表达量显著高于200 μmol/l 雌激素添加组（P＜0.05）；在24 h时，100 μmol/l雌激素添加组CSN2表达量显著高于50 μmol/l 雌激素添加组（P＜0.05）；在48 h 时，200 μmol/l 雌激素添加组CSN2 表达量显著高于50、100 μmol/l 雌激素添加组（P＜0.05）；在72 h 时，200 μmol/l 雌激素添加组CSN2 表达量显著高于50 μmol/l 雌激素添加组（P＜0.05）。其余组各浓度组间差异均不显著。

不添加雌激素及添加50 μmol/l雌激素时，在72 h CSN2 表达量显著高于其他各时间点（P＜0.05）；添加100 μmol/l 雌激素时，在72 hCSN2 表达量显著高于24 h（P＜0.05），且极显著高于12、48 h（P＜0.01），24 h时CSN2 表达量显著高于48 h（P＜0.05）；添加200 μmol/l雌激素时，在72 h 时CSN2 表达量极显著高于其他各时间点（P＜0.01），在48 h时CSN2表达量显著高于24 h（P＜0.05），且极显著高于12 h（P＜0.01），在24 h 时CSN2 表达量显著高于12 h（P＜0.05）。其余各时间组间差异均不显著。图3 是各组在不同时间段时细胞CSN2表达的凝胶图像。

图3 不同雌激素浓度在不同时间段时CSN2表达的凝胶图像

2.3 雌激素对TG表达的影响

由表3 可知，在12 h 时，与对照组相比，添加50 μmol/l 雌激素组其TG 表达量显著高于对照组（P＜0.05），添加100 μmol/l雌激素组其TG表达量极显著低于对照组（P＜0.01）；在24 h 时，与对照组相比，添加50 μmol/l 雌激素组其TG 表达量显著低于对照组（P＜0.05），添加100 μmol/l雌激素组其TG表达量极显著低于对照组（P＜0.01），添加200 μmol/l雌激素组其TG表达量显著高于对照组（P＜0.05）；在48 h时，与对照组相比，添加50 μmol/l雌激素组其TG表达量显著高于对照组（P＜0.05），添加100 μmol/l雌激素组其TG表达量极显著低于对照组（P＜0.01），添加200 μmol/l雌激素组其TG表达量极显著高于对照组（P＜0.01）；在72 h时，与对照组相比，添加50 μmol/l雌激素组其TG表达量显著高于对照组（P＜0.05），200 μmol/l雌激素组其TG表达量极显著高于对照组（P＜0.01）。其余组与对照组间差异均不显著。

表3 不同雌激素浓度在不同时间段对TG表达量的影响（灰度值）

在12 h 时，50 μmol/l 雌激素添加组TG 表达量极显著高于100、200 μmol/l 雌激素添加组（P＜0.01），200 μmol/l 雌激素添加组TG 表达量极显著于100 μmol/l 雌激素添加组（P＜0.01）；在24 h 时，200 μmol/l 雌激素添加组TG 表达量极显著高于50、100 μmol/l 雌激素添加组（P＜0.01），50 μmol/l 雌激素添加组TG 表达量极显著高于100 μmol/l 雌激素添加组（P＜0.01）；在48 h 时，200 μmol/l 雌激素添加组TG表达量显著高于50 μmol/l雌激素添加组（P＜0.05），且极显著高于100 μmol/l 雌激素添加组（P＜0.01），50 μmol/l 雌激素添加组TG 表达量极显著高于100 μmol/l 雌激素添加组（P＜0.01）；在72 h 时，200 μmol/l 雌激素添加组TG 表达量极显著高于50、100 μmol/l 雌激素添加组（P＜0.01），50 μmol/l 雌激素添加组TG 表达量显著高于100 μmol/l 雌激素添加组（P＜0.05）。其余各浓度添加组间差异均不显著。

不添加雌激素时，对照组在24 h 时TG 表达量极显著高于其他各时间点（P＜0.01），在72 h 时TG 表达量极显著高于12、48 h（P＜0.01）；在添加50、100 μmol/l雌激素时，24、72 h时TG表达量显著高于12、48 h（P＜0.05）；在添加200 μmol/l 雌激素时，24、72 h 时TG 表达量极显著高于12、48 h（P＜0.01）。其余各时间点组间差异均不显著。

3 讨论

3.1 雌激素对乳腺上皮细胞中CSN1表达的影响

本实验研究表明，添加雌激素与对照组相比可以促进CSN1的表达。乳腺上皮细胞是乳腺实质腺泡和导管系统的重要组成部分[7]，雌激素可以促进乳腺导管的延伸及乳腺上皮细胞的增殖，进一步促进乳腺分泌乳汁。乳汁中，重要的营养成分之一就是乳蛋白，主要含有乳清蛋白和酪蛋白[8]。随着对激素调控乳腺上皮细胞研究的逐渐深入，雌激素能够促进CSN1 表达的原因可能是雌激素可以激活细胞内与其有关的一些信号传导通路，而这些通路的激活可能与乳腺上皮细胞合成及分泌CSN1的能力有关[9]。杨建英、艾晓杰等[10-11]给荷斯坦牛饲喂大豆黄酮（植物类雌激素）的研究发现，大豆黄酮能够明显的提高牛乳中乳蛋白的含量。在对山羊乳腺的研究中发现，当注射17 β-雌二醇后，可诱导提高乳腺上皮细胞分泌α-酪蛋白的能力[12]。与本试验结果一致。

在50、100、200 μmol/l雌激素添加组中，200 μmol/l高浓度雌激素添加组在24、48、72 h 三个时间段的CSN1的表达量均显著或极显著高于50、100 μmol/l雌激素添加组在这段时间内CSN1的表达量。说明高浓度雌激素添加组能够随时间的增长，更好的促进CSN1 的表达。可能是因为雌激素的浓度升高后，大量的雌激素与其特异性受体发生结合后，诱导乳腺上皮细胞分泌了一些细胞因子，这些因子可能促进了乳腺上皮细胞的增殖，间接的影响了CSN1 的合成[13-14]。卢志勇等[15-17]也做出了同样的结果，他们的研究发现，加入高添加剂量的大豆异黄酮可以使酪蛋白的表达量明显提高，且呈现一定的剂量依赖性趋势。

随着时间的逐渐增加，100、200 μmol/l 雌激素添加组CSN1的表达量呈先上升，48 h时下降，72 h时又再次升高的趋势。这种现象的出现可能与细胞自身合成CSN1 的过程及能力有关，高浓度雌激素添加组在72 hCSN1 的表达量再次升高，可能是改变了细胞内CSN1 的合成模式。具体的机制还不清楚，有待于进一步深入研究。

3.2 雌激素对乳腺上皮细胞中CSN2表达的影响

研究表明，添加雌激素与对照组相比可以促进CSN2的表达。酪蛋白是研究激素对乳腺细胞作用的标志，占乳蛋白的80%[18]，它是乳腺特有的合成蛋白，其他细胞不能够合成。乳腺上皮细胞是合成和分泌乳汁的基本场所。CSN2只在乳腺上皮细胞中分泌[19]，雌激素能够促进CSN2 的表达，可能是因为雌激素可以增强细胞的抗氧化性，减缓细胞的衰老及凋亡，从而提高了细胞自身对分泌CSN2所需营养物质的转化速率，也可能是雌激素可以刺激垂体释放催乳素来调节乳蛋白的合成[20]。程蕾等[21]对乳成分检测结果表明，日粮中添加大豆异黄酮200 mg/kg，乳蛋白含量略有提高。李东[22]的研究结果显示，与对照组相比，经过添加雌激素培养的细胞分泌CSN2 的能力明显提高。李艳等[23]的研究显示，当催乳素、胰岛素和氢化可的松一起添加时，能显著的提高β-酪蛋白。这些研究与本试验的研究结果一致。

200 μmol/l 浓度雌激素添加组CSN2 的表达量在48、72 h时显著或极显著高于50、100 μmol/l浓度雌激素添加组。说明高浓度雌激素添加组在培养时间上升后能有效的促进CSN2的表达。可能是随着雌激素和时间的不断增加，雌激素开始促进乳腺上皮细胞吸收大量的其自身生长所需的营养物质，使乳腺上皮细胞的增殖能力及活力不断提高，进一步合成和分泌CSN2。这之中具体的作用机制还需进一步的探讨研究。

3.3 雌激素对乳腺上皮细胞中TG表达的影响

本试验研究表明，添加雌激素与对照组相比可以促进TG 的表达。乳脂肪的主要成分为甘油三酯、磷脂和甾醇，是牛奶中主要的能量成分。乳脂肪在体内主要是以甘油三酯的形式存在。雌激素可以促进TG的表达，可能是雌激素通过旁分泌或自分泌的方式分泌了一些细胞因子，这些因子进入到血液后，促进了血液中胰岛素样生长因子（IGF-I）的含量逐渐升高，IGF-I 进一步的作用于下丘脑和垂体，促进垂体分泌了大量的催乳素及生长激素等，这些激素含量的变化直接或间接的引起了乳脂含量的变化[11]，也可能是雌激素通过诱导乳腺上皮细胞，使其自身分泌更多的催乳素，催乳素通过PI3K/AKT 途径促进了乳脂的合成[24]。艾晓杰、程蕾[11，21]等对乳成分检测后发现，日粮中添加大豆异黄酮，乳脂肪含量极显著升高。与本试验的研究结果一致。

在50、100、200 μmol/l雌激素添加组中，200 μmol/l浓度雌激素添加组在24、48、72 h三个时间段的CSN1的表达量均显著或极显著高于50、100 μmol/l 雌激素添加组在这段时间内CSN1的表达量。说明高浓度雌激素添加组能够随时间的上升，更好的促进TG 的表达。其原因可能是雌激素作为生理调节剂，随着浓度的不断增加，促进大量其他因子的不断分泌，这些因子进入到血液中，诱发了催乳素，IGF-I及促黄体素等一些内源性激素的水平发生了改变，促进乳腺上皮细胞大量的合成和分泌乳脂。

随着时间的逐渐增加，各浓度雌激素添加组TG的表达量呈先上升，48 h 时下降，72 h 时又再次升高的趋势。其具体的机制目前还尚不清楚，有待进一步的研究。

4 结论

综上所述，添加雌激素可以促进乳腺上皮细胞中CSN1、CSN2 及TG 的表达。且在50、100、200 μmol/l这三种浓度的雌激素添加组中，200 μmol/l 在一定条件下促进CSN1的表达效果最好；100、200 μmol/l雌激素添加组均能够促进CSN2 的表达，且100 μmol/l 促进CSN2 的表达效果最好，尤其是在12、24 h；50、200 μmol/l 雌激素添加组可以促进TG 的表达，但100 μmol/l雌激素添加组能够抑制TG的表达。