EDA及受体EDAR在胚胎小鼠背部毛囊形成期的表达

吴佳豪，曹靖，李超，陆娜，吴晋强，闫瑞琴，张娇娇，张鹏翔，赫晓燕*

(1.山西农业大学 动物科技学院，山西 太谷 030801；2.北京农业职业学院 畜牧兽医系，北京 房山 102442)

毛囊(Hair Follicles)是最为独特和复杂的微型器官之一，是哺乳动物中惟一终生呈周期性生长的皮肤的附属器官。由于毛囊结构清楚，数量较多且处于体表，易于操作和研究[1]，所以毛囊是研究细胞的增殖、分化及凋亡等重要生命科学问题的良好模型，也是系统生物学研究的理想模型，因此探究毛囊的形成及发育具有重要意义[2,3]。

毛囊形成开始于胚胎早期，经历诱导期、器官发生期和细胞分化期，由真皮细胞(间充质细胞)与信号分子介导的上皮细胞之间的相互作用发育而成[4]。目前，已发现了多个参与调控毛囊形态发生和生长周期所需要的Wnt，Shh[5]，HGF，EDA/EDAR信号通路等，而这些信号通路中EDA/EDAR信号通路对毛囊的形成，尤其是毛囊形成的起始阶段有至关重要的作用[6～9]。

外胚层发育不全基因(Ectodysplasin A, EDA)在1988年由Zonana首次发现，在1996年由Kere等首次克隆成功并鉴定其cDNA，发现其编码的蛋白EDA属于肿瘤坏死因子(Tumor Necrosis Factor, TNF)家族的配体[10,11]。EDAR作为EDA的受体也是TNF家族的成员[12,13]。研究表明一些外胚层附属物如头发、牙齿、毛囊等的正常生长发育都需要EDA和EDAR的调控[14]，EDA和EDAR可以控制胚胎期小鼠背部皮肤上皮细胞和间充质细胞的生长状况，进而影响毛发基板的形成和发育，调控毛囊细胞的分化过程来影响动物毛囊的生长。还有研究表明某些基板的形成完全是EDA/EDAR基因调控的结果[15]。但截至目前，有关EDA/EDAR对小鼠背部毛囊形成期产生的作用尚未进行系统的研究。

本研究通过苏木精-伊红(HE)染色试验对小鼠胚胎期第13～18天背部皮肤组织学结构特征进行观察。同时通过免疫组织化学试验观察EDA和EDAR蛋白在胚胎小鼠背部毛囊形成期的表达，分析EDA和EDAR蛋白在胚胎小鼠背部毛囊形成过程中的表达差异，旨在探究EDA和EDAR对胚胎期小鼠背部毛囊形成是否有促进作用[16,17]，并对其作用进行初步判断，为进一步的探究奠定基础，进而为揭示EDA和EDAR对小鼠毛发生长调节机制提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 试验动物

从山西医科大学购买ICR小鼠(未怀孕母鼠30只，公鼠10只)，分开饲养20 d后，将未怀孕母鼠与公鼠进行合笼。隔天观察阴道栓，将有阴道栓的母鼠单独分笼并标记为怀孕，且此天记为E1，此后每天以此类推。分别取E13、E14、E15、E16、E17和E18胚胎小鼠，每日龄各取3只，固定于Bouin’s固定液中。

1.2 主要试剂和仪器

试验试剂：二甲苯，梯度乙醇溶液，苏木精染料，伊红溶液，PBS缓冲液，兔抗EDA多克隆抗体(Abcam公司)，兔抗EDAR多克隆抗体(武汉三鹰生物科技有限公司)，兔Streptavidin-HRP DAB试剂盒(康为世纪生物科技有限公司)。

试验仪器：BS124S电子天平(北京赛多利仪器系统有限公司)，Leica研究型显微镜(德国Leica公司)，SK200显微镜(麦克奥迪实业集团有限公司)，YD-6 L石蜡包埋机(浙江省金华市益迪医疗设备厂)，RM-2265石蜡切片机(德国Leica公司)。

1.3 组织包埋及切片制作

将固定液处理过的胚胎小鼠取出，清洗，梯度乙醇溶液(浓度由低到高直至无水)脱水处理之后，放入混合液中20 min(混合液为无水乙醇∶二甲苯=1∶1)，接着用二甲苯透明1 h，浸蜡2.5 h后平整包埋于预先准备的纸盒中，过夜凝固后于4 ℃环境中保存。将包埋好的蜡块修整成规整的长方形，且保证组织周围蜡层不薄于2 mm。制作6 μm厚的切片，以备后续试验使用。

1.4 苏木精-伊红染色法(HE染色)

将制备好的石蜡切片依次浸润于二甲苯、梯度乙醇溶液(浓度由高到低)中进行脱蜡和复水，蒸馏水洗涤。后将切片置于苏木精中染色，经盐酸分化后用自来水冲洗返蓝，蒸馏水洗涤。再将切片依次浸润于(70%～90%)乙醇溶液中，后置于伊红中染色。将染好的切片依次浸润于95%乙醇溶液、无水乙醇、二甲苯中脱水，透明后，用中性树脂封片。

待切片晾干之后，放置于显微镜下观察，获取图像，储存分析。

1.5 免疫组织化学

将制备好的石蜡切片置于二甲苯、梯度乙醇溶液(浓度由高到低)中进行脱蜡和复水，后用PBS缓冲液充分淋洗。将切片放置于保湿盒内，依照DAB试剂盒说明书进行试验。滴加适量Solution A溶液，室温孵育10 min后PBS缓冲液充分淋洗；滴加适量Solution B溶液，室温孵育10 min后移除一侧组织的Solution B，滴加适量对应抗体，放置于4 ℃环境中过夜，次日室温复温后，用PBS缓冲液充分淋洗；滴加适量Solution C溶液，室温孵育10 min后PBS缓冲液充分淋洗；滴加适量Solution D溶液，室温孵育10 min后PBS缓冲液充分淋洗；滴加适量DAB显色液，显微镜下观察显色程度以控制显色时间，显色后将切片用蒸馏水洗涤，后置于苏木精中染色，经盐酸分化后用自来水冲洗返蓝，再用蒸馏水洗涤。将切片依次置于梯度乙醇溶液(浓度由低到高直至无水)、二甲苯中脱水，透明，最后用中性树脂封片。

待切片晾干之后，置于显微镜下观察，获取图像，储存分析。

1.6 统计分析

免疫组织化学结果图利用图像分析软件Image-pro plus进行光密度分析并记录数据，各蛋白表达差异显著程度均以平均光密度值最低那天为对照。其中*P<0.05，**P<0.01,***P<0.001分别表示差异的显著程度。

2 结果与分析

2.1 胚胎小鼠背部毛囊发育各阶段组织学结构特征

通过对E13～E18胚胎小鼠切片进行HE染色试验，观察其背部皮肤。结果显示：在E13表层细胞排列紧密，开始出现分层现象但不明显(图1-A)。E14表皮由三层以上的表皮细胞组成，此时表皮细胞大量增殖，表皮的基底层细胞下陷进入真皮中凝集的间充质细胞内形成毛胚(图1-B)。E15毛胚突起增多，表皮角质形成细胞变长且变宽(图1-C)。E16表层细胞形成角化层，毛芽形成毛钉并成为一种固定的长柱状上皮细胞(图1-D)。E17毛钉进一步发育变长，易识别球状毛乳头(图1-E)。E18毛钉继续发育，表现出未成熟毛囊的特征，即近端球状增厚，毛乳头变宽。(图1-F)。

图1 HE染色结果图(40×)Fig.1 HE staining results diagrams(40×)1：表层细胞；2：基底层；3：真皮；4：基板(毛胚)；5：毛芽；6：毛钉；7：未成熟毛囊；图A～F分别为E13～E18背部皮肤HE染色结果1: Epidermis cells; 2: Basal layers; 3: Dermis; 4: Placodes(Hair germs); 5: Hair buds; 6: Hair pegs; 7: Immature hair follicles；Figures A～F show the results of HE staining of E13～E18 dorsal skin respectively

2.2 EDA蛋白在胚胎小鼠背部毛囊形成期的表达

EDA蛋白免疫阳性反应结果显示，E13～E18广泛表达于表皮和真皮各部，但在发育不同阶段，表达强度存在差异。E13在表层细胞和基底层中表达明显，在真皮中广泛表达(图2-A)；E14在表皮内陷形成的基板中出现表达，真皮中散在表达(图2-B)；E15在表层细胞中有表达，在毛芽中出现表达(图2-C)；E16在表层细胞中表达明显，而在毛钉中亦有表达(图2-D)；E17在表层细胞和毛钉中都有表达(图2-E)；E18在表层细胞，真皮，未成熟毛囊表达明显(图2-F)。阴性对照组则均未出现阳性反应(图2-a～f)。

图2 EDA蛋白免疫反应结果图(40×)Fig.2 EDA proteins immune response results diagrams(40×)1：表层细胞；2：基底层；3：真皮；4：基板(毛胚)；5：毛芽；6：毛钉；7：未成熟毛囊；图A～F分别为E13～E18背部皮肤EDA蛋白免疫阳性反应结果；图a～f为阴性对照1: Epidermis cells; 2: Basal layers; 3: Dermis; 4: Placodes(Hair germs); 5: Hair buds; 6: Hair pegs; 7: Immature hair follicles； Figures A～F show the results of EDA proteins immune positive response of E13～E18 dorsal skin respectively; Figures a～f are the negative control

2.3 EDAR蛋白在胚胎小鼠背部毛囊形成期的表达

EDAR蛋白免疫阳性反应显示，在E13～E18在各个部位均有不同程度的表达，但表达强度存在较明显差异。E13广泛表达于表层细胞、基底层和真皮(图3-A)；E14基板形成，在表层细胞和基板中均有表达(图3-B)；E15可见毛钉的早期结构——毛芽，主要在表层细胞中表达，毛芽中散在表达(图3-C)；E16在表层细胞形成的角化层中表达很明显，在基底层以及毛钉中也均有明显地表达(图3-D)；E17在表层细胞有表达，在毛钉中少量表达，即表达相较前一天明显减弱(图3-E)；E18在表层细胞中未出现表达，而在基底层，真皮和未成熟毛囊中有表达(图3-F)。阴性对照组则均未出现阳性反应(图3-a～f)。

2.4 EDA、EDAR蛋白在胚胎小鼠背部毛囊形成期的平均光密度分析

光密度数据分析结果如图4，EDA和EDAR蛋白在毛囊形成的不同阶段中表达水平存在较显著差异，且EDA蛋白表达强度整体高于EDAR蛋白。其中EDA蛋白在E13表达量相对较高，E14降至最低且极显著(P<0.001)低于其他各天。E15，E16逐渐升高，E17略有降低，E18升至最高。EDAR蛋白在E13表达量相对较高，E14降低，E15相对升高，E16升至最高，E17降至最低且极显著(P<0.001)低于其他各天，E18升高至较高水平。二者变化趋势有相似之处，都经历先降低而后到E16升高之后再降低，后再相对升高的相似的表达趋势。

3 讨论

有研究表明小鼠背部毛囊于胚胎期第13天后开始形成，此后至第18天处于毛囊形成期的诱导期和器官发生期，并包含以下几个阶段：第0阶段，即前毛胚阶段，其特征为“核的聚集”；第1阶段称毛胚，它被认为是早期的毛囊前体细胞。当表皮基底细胞下陷进入真皮中，被聚集的间充质细胞包围，形成毛胚细胞或称为基板；第2阶段毛胚突起增多，主要是基底层细胞大量增殖的结果；第3阶段像索状上皮细胞的毛胚细胞继续伸长之后被称为毛钉或毛脚，此时易识别球状毛乳头；第4阶段毛钉进一步发育表现出未成熟毛囊的第一特征，即近端球状增厚和毛乳头变宽[18～20]。

图3 EDAR蛋白免疫反应结果图(40×)Fig.3 EDAR proteins immune response results diagrams(40×)1：表层细胞；2：基底层；3：真皮；4：基板(毛胚)；5：毛芽；6：毛钉；7：未成熟毛囊；图A～F分别为E13～E18背部皮肤EDAR蛋白免疫阳性反应结果；图a～f为阴性对照1: Epidermis cells; 2: Basal layers; 3: Dermis; 4: Placodes(Hair germs); 5: Hair buds; 6: Hair pegs; 7: Immature hair follicles；Figures A～F show the results of EDAR proteins immune positive response of E13～E18 dorsal skin respectively; Figures a～f are the negative controls

图4 平均光密度分析结果图Fig.4 results diagrams of average optical density analysis*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001

通过HE染色试验结果可知：E13表层细胞增殖，出现较不明显的分层现象，判断此时处于毛囊发育的第0阶段。E14表层细胞大量增殖，出现分层现象，即表层细胞和基底层，同时，除分层现象外，小鼠背部皮肤表层细胞的排列也不尽相同。由开始时的排列散且较少，逐步发育到此时的排列规则，密而多；而真皮细胞增殖并凝集开始形成基板，判断此时处于毛囊发育的第1阶段。E15基板突起增多，判断此时处于毛囊发育的第2阶段。E16毛胚逐渐发育为毛钉，E17随着胚胎的进一步发育生长，毛钉逐渐增大，易识别球状毛乳头，此时处于毛囊发育的第3阶段。E18开始出现毛乳头的初始形态，判断此时处于毛囊发育的第4阶段。这与Paus等人研究发现的结果一致[20]。

Laurikkala J等通过组织切片的原位分子杂交对Tabby和Lef1突变的野生型小鼠胚胎中EDA和EDAR的表达和调控进行分析，发现EDA和EDAR的表达局限于外胚层，并且以一种模式发生，暗示了在外胚层间隔和毛发基板的形成和功能间的交互作用中EDA/EDAR信号的角色；他们认为活化素作为间充质信号刺激EDAR的表达，Wnt作为信号诱导EDA的表达，在皮肤和毛囊发育中信号通路有明显等级；他们提出EDA和EDAR与外胚层发病模式密切相关，EDA/EDAR信号同时也调节毛囊的形态发生[21]。

免疫组织化学试验结果显示EDA和EDAR蛋白在E13出现表达，且在之后的数天中EDA和EDAR蛋白在某一部位的表达量有所不同。这说明EDA和EDAR对胚胎期小鼠背部毛囊的形成有影响，但在毛囊形成期不同阶段，其作用程度以及作用结果可能各不相同。

EDA和EDAR蛋白在胚胎期毛囊发育的各个阶段广泛表达于表层细胞和基底层。EDA蛋白在E13的表达量相对较高，此时处于毛囊发育的第0阶段，因此猜测EDA在毛囊形成期扮演启动信号的角色，E14表达量较E13有所下降，之后到E16逐渐升高，此时经历了毛囊发育的第1～第3阶段，因此推测EDA对于基板进一步发育形成毛钉可能有重要作用，而在E17表达量降至相对较低或许是对毛钉的发育作用相对较小，E18相对表达量最高，此时处于发育的第4阶段已具备毛囊基本雏形，因此推测EDA对未成熟毛囊进入细胞分化期并进一步发育可能有促进作用。EDAR蛋白在E13表达量相对较高，此时处于毛囊发育的第0阶段，因此推测EDAR也同样对表皮的分化具有诱导作用，E14、E15表达水平较低进而推测其对第1和第2阶段作用较小，E16表达量达到峰值，此时处于毛囊发育的第3阶段，推测EDAR对于毛钉的形成和发育有重要作用，E17、E18表达水平较低进而推测其对第4阶段作用较小[22]。Laurikkala J等对EDA和EDAR在胚胎小鼠皮肤中的表达和调控分析发现：EDA和EDAR被检测到的部位仅为小鼠皮肤外胚层和毛囊，推断EDA和EDAR发挥作用即表达的部位可能主要为外胚层以及毛囊的某些结构。本试验结果与这一分析吻合[21,23]。

光密度结果显示，EDAR作为EDA的受体变化趋势与EDA有相似之处都在E13表达量相对较高，初期二者多集中于表皮和真皮，由此推测EDA及其受体EDAR在表皮增殖方面和毛囊形成的诱导期可能具有作用。在E16达到峰值，之后有下降趋势，而E16时毛钉已具备早期雏形，所以二者对毛钉的形成或进一步发育有共同作用。不同之处是EDA蛋白在E14表达量最低，且集中表达于基板，这与Smahi A等发现有吻合之处。Smahi A等发现某些基板的形成完全是EDA/EDAR调控的结果，有些基板在形成过程中缺少EDA，会产生发育异常的毛发，这表明EDA对于毛囊的形成有重要的影响[15]。EDAR蛋白在E17降至最低，推测可能对未成熟毛囊的形成作用较小。

由于胚胎小鼠背部毛囊的形成受到许多基因的调控和许多信号通路的相互作用，是一复杂的生理过程。有研究表明EDAR作为EDA的受体在参与毛囊形成的过程中还参与其他生命活动，且EDAR作为受体不仅可与其配体EDA结合，还可与其他配体结合而行使生命活动中的其他功能[22,24]，所以二者变化趋势并非完全一致，在毛囊形成过程中二者可能通过互相结合形成的复合体发挥作用[25]，因此在E13和E16的表达水平有相似性，但要了解二者之间的相互作用以及对胚胎小鼠背部毛囊形成期的具体影响需做进一步的探索和研究。

4 结论

试验结果显示，在E13～E18毛囊形成所经历的五个阶段中：从表达部位看，EDA蛋白在表皮和真皮中都广泛表达；从表达强弱来看，E13表达量较高，E16和E18表达量很高，提示EDA可能对毛囊形成的启动有促进作用，且可能主要影响毛钉的形成和未成熟毛囊的发育。EDAR蛋白则广泛表达于表层细胞、基板和毛钉等结构；同EDA蛋白表达趋势类似，E13表达量较高，在E16表达最强，随后逐渐减弱。提示EDAR可能对表皮的分化有诱导作用，且可能促进毛钉的形成及发育。