白藜芦醇诱导人乳腺癌MDA-MB231细胞凋亡及自噬

朱 涛，涂淑贞，杨阳丽，许礼发，刘群红

(安徽理工大学医学院前沿医学中心，安徽 淮南 232001)

乳腺癌属于全世界范围内多发性的恶性肿瘤，每年新增约120万女性患者，死亡50万名患者。我国目前乳腺癌患者发病率和增速都很快，其原因可能与乳腺癌的高侵袭力和转移有关，因此，如何抑制癌细胞增殖、降低侵袭转移和促进凋亡是治疗的基础[1]。中药由于具有多靶点、疗效好、副作用小等优点，当前已广泛用于肿瘤的临床治疗。白藜芦醇(resveratrol，Res)是葡萄、虎杖等植物中的多酚类化合物，具有抗氧化、免疫调节、抗肿瘤等药理作用[2]。细胞凋亡是在基因严格调控下的逐渐死亡，真核生物细胞衰老、变性的细胞器需要通过自噬-溶酶体途径降解，可抑制细胞内致突变物的聚集，减少基因突变，故凋亡和自噬可以稳定细胞内环境作用[3]。Res能否通过凋亡和自噬作用抑制乳腺癌MDA-MB231细胞增殖，目前尚未见文献报道。本研究采用不同浓度Res体外作用于人乳腺癌MDA-MB231细胞，通过观察Res抑制乳腺癌细胞的增殖和诱导凋亡作用，进一步探讨Res抑制乳腺癌细胞增殖的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1细胞株 人乳腺癌MDA-MB231细胞株，由中国上海细胞研究所提供。

1.1.2试剂 Res(分子式C14H12O3，CAS号：501-36-0，纯度≥99%，美国Sigma公司)；DMEM高糖培养基、胎牛血清(FBS)，均购自美国HyClone公司；四甲基偶氮唑盐(MTT)试剂盒、二甲亚砜(DMSO)、牛血清白蛋白(BAS)、β-巯基乙醇等试剂，均购自美国Amresco公司；Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒(美国BD公司)；一抗LC3Ⅰ/Ⅱ、p62、Beclin-1、β-actin，均购自美国Cell Signal公司；BCA蛋白定量试剂盒、ECL超敏发光液(美国Pierce公司)；其他试剂为国产分析纯。

1.1.3仪器 酶联免疫分析仪(美国BioTek公司)；激光共聚焦显微系统(德国Leica公司)；流式细胞仪(美国BD公司)；凝胶成像系统(美国Thermo Fisher公司)。

1.2 方法

1.2.1MTT法测定Res对MDA-MB231细胞增殖的影响 对数生长期的MDA-MB231细胞(1.0×105·L-1)，按照每孔50 μL接种于96孔板培养24 h后，加入Res(终浓度0、1、5、10、20、50、100、200 mg·L-1)50 μL，每组设5个复孔。置37 ℃、饱和湿度、5% CO2孵育箱中培养48 h，每孔加入5 mg·L-1MTT溶液20 μL，培养4 h；弃培养基，加入DMSO中止反应，待结晶紫溶解后，酶标仪检测各组MDA-MB231细胞在570 nm处的吸光度值(OD值)，计算细胞生长抑制率：细胞生长抑制率%=(1-给药组OD值/对照组OD值)×100%。

1.2.2划痕实验测定细胞迁移能力 将浓度为1.0×106·L-1的MDA-MB231接种于6孔培养板中，常规培养48 h后，弃培养基，沿每孔中轴，微量吸液管枪头在单层乳腺癌细胞表面划痕，磷酸盐缓冲液(PBS)洗5 min×3次，充分洗去细胞残渣，加入含Res(终浓度0、5、20、60 mg·L-1)的DMEM培养基于6孔板中，再次置于37 ℃、5% CO2培养箱中，培养48 h，拍照，计算细胞划痕愈合率，细胞划痕愈合率=(初始划痕宽度-48 h划痕宽度)/初始划痕宽度×100%。

1.2.3流式细胞术检测细胞凋亡 MDA-MB231细胞接种于6孔板(1.0×106个/孔)，Res(终浓度0、5、20、60 mg·L-1)作用24 h后，PBS洗涤2次，先后加入AnnexinV-FITC和碘化丙啶(PI)双标记染液，轻轻混匀，4 ℃避光孵育0.5 h，流式细胞仪检测及结果分析。

1.2.4免疫荧光检测LC3Ⅰ/Ⅱ蛋白在MDA-MB231中的表达 MDA-MB231细胞接种于6孔板中(1.0×106个/孔)，培养24 h后，加入Res(终浓度0、5、20、60 mg·L-1)，按照试剂盒说明书，准备细胞爬片，常规培养48 h，去除培养基，4%丙酮固定0.5 h，PBS洗涤10 min×2次；0.1% Triton X-100透膜15 min，PBS洗涤10 min×2次；山羊血清封闭0.5 h，滴加抗LC3Ⅰ/Ⅱ抗体(1 ∶200)50 μL，4 ℃孵育过夜，PBS洗涤；荧光标记二抗(1 ∶300)37 ℃避光处理1 h，抗荧光淬灭剂封固，激光共聚焦显微镜观察、摄片。

1.2.5蛋白免疫印迹法检测自噬相关蛋白p62、Beclin-1表达 1.0×106个MDA-MB231细胞接种到25 mL培养瓶中，加入5 mL DMEM培养液，培养24 h后，加入Res(终浓度0、20、60 mg·L-1)作用48 h，蛋白裂解液提取细胞总蛋白，蛋白浓度测定采用BCA法，取30 μg总蛋白进行SDS-PAGE电泳，转膜，5%脱脂奶粉封闭，加入一抗p62(1 ∶1 500)、Beclin-1(1 ∶2 000)、β-actin(1 ∶2 000)，4 ℃孵育过夜；次日洗膜后加入二抗，37 ℃孵育1 h，TBST液充分洗膜，ECL化学发光，显影、定影。

2 结果

2.1 Res对MDA-MB231细胞增殖的影响Res作用MDA-MB231细胞48 h后，MTT法检测表明，如Fig 1所示，与对照组(Res 0 mg·L-1)相比，Res抑制MDA-MB231细胞的增殖呈浓度依赖性(P<0.05)，其IC50值为49.2 mg·L-1。

Fig 1 Effect of Res on proliferation of breast cancer

*P<0.05, **P<0.01 vs Res (0 mg·L-1)

2.2 Res对MDA-MB231细胞迁移能力的影响如Fig 2所示，Res(0、5、20、60 mg·L-1)作用48 h后，与对照组比较，Res可抑制乳腺癌细胞的迁移能力，以对照组愈合率为100%计算，Res(5、20、60 mg·L-1)组乳腺癌细胞划痕愈合率分别降低至(91.3±3.6)%、(83.5±4.6)%、(67.8±5.1)%。

2.3 Res上调MDA-MB231细胞的早期凋亡率Res(5、20、60 mg·L-1)处理MDA-MB231细胞24 h后，AnnexinV-FITC/PI双染MDA-MB231细胞，检测细胞早期凋亡率。如Fig 3所示，与对照组比较，Res组细胞早期凋亡率明显增加(P<0.05，P<0.01)。

Fig 2 Effect of Res on 48 h migration

*P<0.05, **P<0.01 vs Res (0 mg·L-1)

2.4 Res上调MDA-MB231细胞中LC3Ⅰ/Ⅱ蛋白表达激光共聚焦显微镜显示(Fig 4)，对照组MDA-MB231细胞的胞质和胞核中LC3Ⅰ/Ⅱ绿色荧光强度较弱。Res(5、20、60 mg·L-1)作用MDA-MB231细胞后，MDA-MB231细胞的胞质和胞核中LC3Ⅰ/Ⅱ绿色荧光强度增强明显，分布不均匀，以Res高浓度(60 mg·L-1)更为明显。

2.5 Res对MDA-MB231细胞自噬相关蛋白p62、Beclin-1表达的影响Fig 5的Western blot结果表明，Res(20、60 mg·L-1)作用MDA-MB231细胞48 h后，与对照组比较，随着Res浓度的升高，细胞中p62蛋白表达明显降低，而Beclin-1蛋白表达明显升高(P<0.05，P<0.01)。

3 讨论

乳腺癌是女性发病率最高的恶性肿瘤之一，且呈逐年上升趋势，其发生、发展的分子机制目前尚不完全明确，科研人员也不断研究和探索相关治疗该肿瘤的新药。天然多酚类化合物Res药理学活性广，有相关研究证实，Res具有抗肿瘤作用，可抑制肝癌、肺癌、膀胱癌等多种肿瘤细胞生长[4-6]。本研究利用MTT法，检测Res对人乳腺癌MDA-MB231细胞生长的影响，结果表明，Res对乳腺癌细胞有增殖抑制作用，且抑制作用与Res浓度呈正相关。

Fig 3 Effect of different concentrations of Res on early apoptosis in MDA-MB231

Fig 4 Expression of LC3Ⅰ/Ⅱ of Res-treated MDA-MB231

A:Res (0 mg·L-1) ；B:Res (5 mg·L-1) ；C:Res (20 mg·L-1) ；D:Res (60 mg·L-1)

Fig 5 Effect of Res on p62 and Beclin-1 protein expressions

*P<0.05,**P<0.01vsRes (0 mg·L-1)

肿瘤细胞凋亡是化疗药物作用的重要机制，细胞早期凋亡状态下，细胞膜呈不对称性丢失，其明显特点是细胞膜表面出现磷脂酰丝氨酸(PS)，暴露于凋亡细胞膜外，而Annexin V是检测PS的敏感探针，通过流式细胞仪，应用Annexin-Ⅴ联合PI可定量标记凋亡细胞[7]。选择利用碘化丙啶(PI)，则可以区分Annexin V染色后的凋亡细胞和坏死细胞。本研究采用Annexin-Ⅴ/PI双染技术进行检测，结果表明，Res作用乳腺癌MDA-MB231细胞24 h后，乳腺癌细胞早期凋亡比例明显升高，且随着Res浓度的增加而增多，提示Res抑制人乳腺癌细胞增殖的机制可能与诱导其凋亡有关。

自噬是一种新的细胞降解途径，为保守的细胞自我降解，溶酶体吞噬自身胞质或细胞器，从而再利用细胞内营养和能量，近年来被广泛关注。在机体发育和抗老化等生理过程中，必需维持基础水平的自噬。机体氧化应激、内环境稳态失调、缺乏营养等改变，会引起细胞自噬发生，进行机体细胞的自我保护，将待降解受损细胞器或胞质包装形成自噬体，再与溶酶体融合和降解；当外界环境恶化没有改善，细胞将启动程序性死亡过程。在恶性肿瘤的发生、发展演变中，肿瘤细胞常出现自噬功能失调，在机体抗肿瘤治疗中，细胞DNA损害、染色体稳定性降低均与自噬有关，控制肿瘤细胞的自噬过程有可能成为改善肿瘤治疗，增加化疗药物的耐药[8-10]。微管相关蛋白轻链3(LC3Ⅰ/Ⅱ)是自噬活性标志物，可反映自噬活性[9]。本研究激光共聚焦显微镜观察发现，与对照组比较，Res作用MDA-MB231细胞后，在癌细胞的细胞质、细胞核中LC3Ⅰ/Ⅱ绿色荧光强度分布明显增强，且高浓度Res作用的乳腺癌细胞中，LC3Ⅰ/Ⅱ绿色荧光强度更为明显，表明Res处理有促进乳腺癌细胞自噬作用。Beclin-1和p62均是细胞内重要的自噬标记蛋白，相关研究表明[10]，Beclin-1基因敲除的小鼠较野生型小鼠体内易出现细胞器和蛋白质的异常积聚，形成恶性肿瘤。p62失活会减弱自噬，细胞核DNA更易出现损害而形成肿瘤。在本研究中，Western blot结果表明，与对照组比较，Res可上调MDA-MB231细胞中Beclin-1蛋白表达，而降低p62蛋白表达。提示Res作用后，乳腺癌细胞自噬相关蛋白Beclin-1、p62蛋白表达发生了改变。

综上分析，本研究证实Res可抑制人乳腺癌MDA-MB231细胞增殖，促进其凋亡，引起LC3Ⅰ/Ⅱ、Beclin-1、p62等自噬相关蛋白的表达改变，提示自噬有可能参与Res抑制乳腺癌细胞增殖过程中，但具体作用方式，与乳腺癌激素受体关系以及自噬是否为引发细胞凋亡的直接因素等，仍需进一步深入研究与探索。

(致谢：本实验在安徽理工大学医学院前沿医学中心实验室完成，在此感谢安徽理工大学医学免疫教研室吴静副教授、蔡茹教授对本实验的支持和帮助。)