双酚A对稀有鮈鲫胚胎及仔鱼的急性毒性

周家辉，陈涛涛，李芹，史晋绒*，王永明

(1.内江师范学院 生命科学学院，四川 内江 641112； 2.上海海洋大学 水产与生命学院，上海 200120)

双酚A(bisphenol A，BPA)属双酚类化合物，是一种内分泌干扰素，具有弱雌激素样及强抗雄激素样作用[1-4]。BPA可通过食品包装材料进入食品或饮料中，从而进入人体。研究表明， BPA对人的皮肤、呼吸道、消化道和角膜等有中等强度刺激[1]，胎儿出生前低剂量的BPA暴露会改变体内的生物代谢途径[5]。稀有鮈鲫(Gobiocyprisrarus)，俗称金白娘、墨线鱼，隶属于鲤形目、鲤科、鮈鲫属，为我国特有小型鱼类，主要自然分布于四川汉源县、都江堰市、彭州市等地[6]。稀有鮈鲫具有个体小、易饲养、对温度和溶解氧等环境条件适应性强、不易染病、性成熟快、卵透明等优点[7]，是化学品毒性测试和环境水样毒性试验的理想材料[8]。

BPA作为一种内分泌干扰物，会对机体的内分泌系统造成一定影响，尤其会导致胎儿出现发育障碍和损伤[9]。BPA对鱼类早期发育的影响有诸多报道，任文娟等[10]使用BPA及其衍生物对斑马鱼胚胎和幼鱼进行暴露，结果显示斑马鱼胚胎出现心包水肿、卵黄囊肿、脊柱弯曲和尾部弯曲等症状。杨丽华等[11]对BPA暴露下斑马鱼幼鱼的神经行为进行了研究，斑马鱼幼鱼的整体平均运动速率显著降低。稀有鮈鲫作为一种理想的实验鱼类，目前尚无BPA对其早期发育影响的报道。本研究旨在为BPA对鱼类早期发育阶段的毒性效应提供基础资料。

1 材料与方法

1.1 材料

实验用鱼为本实验室长期饲养的健康性成熟稀有鮈鲫，饲料(3081)购自正大集团，试验用水为充氧饱和、24.3±0.3 ℃去离子水，配置25 mg·L-1BPA储备液备用。

1.2 方法

1.2.1 饲养管理

选取实验室内长期饲养的健康性成熟稀有鮈鲫作为亲鱼，以雌雄比1∶2饲养于实验室内循环养殖系统中(水中溶解氧≥7 mg·L-1)，每日定时投喂饲料2次，外加丰年虫1次，投喂15 min后及时吸去残饵，水温保持在(26.0±1.0)℃、pH值7.0，光照周期12 h/12 h(光照/黑暗)。通过昼夜节律控制，使稀有鮈鲫每日20:00左右产卵。当观察到雄鱼追逐雌鱼，并用头部顶撞雌鱼腹部等产卵迹象时，将亲鱼捞出，人工干法授精获取受精卵。受精卵一部分用于试验，剩余部分用于测定受精率。

1.2.2 胚胎试验

挑选形态正常、卵径大小基本一致的胚鱼卵进行试验。根据预试验结果，设置0、2、4、8、16 mg·L-1等5个浓度BPA处理组和1个酒精对照组，每个处理设3个平行。每个平行放入胚鱼卵30粒，置于直径12.0 cm、高2.0 cm有盖培养皿中，(24.3±0.3)℃培养至受精后96 h。试验期间及时剔除死亡个体，每隔24 h更换50%同浓度处理液，记录胚胎死亡率、孵化率、心率等指标。参考文献[12]，受精卵至肌肉效应期前，肉眼观察到胚胎呈白色，即为死亡；肌肉效应期至出膜期，胚体停止摆动、心跳消失且半透明胚胎上有一系列不透光的污点出现，即为死亡。

1.2.3 仔鱼试验

根据预试验结果，试验设置0、2、4、6 mg·L-1等4个浓度BPA处理组和1个酒精对照组。将处理液加入培养皿中，每个培养皿放入10条孵化24 h发育正常、游动迅速的仔鱼，每隔24 h观察仔鱼死亡率及形态学特征，试验期96 h。卵黄囊期仔鱼出现呼吸、心跳停止或缺乏机械刺激反应时，即为死亡。统计卵黄囊期仔鱼水肿发生的严重程度，以水肿面积作为衡量标准。

1.2.4 统计分析

利用SPSS 19.0按照概率单位法计算处理试验末期的半数致死浓度(LC50)，根据单因素方差分析法比较差异显著性，P<0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 BPA处理稀有鮈鲫胚胎和仔鱼的半数致死浓度

如表1所示，随着BPA浓度升高，稀有鮈鲫胚胎和仔鱼的死亡率逐渐增加，BPA对稀有鮈鲫胚胎和仔鱼的96 h半数致死浓度分别为10.096、4.237 mg·L-1。

表1 BPA处理稀有鮈鲫胚胎和仔鱼的半数致死浓度

2.2 BPA对胚胎期稀有鮈鲫的毒性效应

BPA对稀有鮈鲫胚胎的毒性效应表现为胚胎孵化延迟、孵化率降低、心率不齐等，空白组和对照组胚胎发育正常(图1)。

BPA暴露导致稀有鮈鲫胚胎心率降低、血液循环减慢。一定浓度范围内，心率随BPA浓度的升高而下降，16 mg·L-1BPA处理组心率显著低于其他处理(表2)。BPA暴露导致胚胎孵化延迟甚至无法出膜，空白组胚胎在96 h内基本全部出膜，4 mg·L-1BPA处理组出膜率仅为8%，而8 mg·L-1BPA处理组出膜率为0，所有暴露组均显著低于空白组。

表2 BPA对胚胎期稀有鮈鲫孵化率和 胚胎心率的影响

注：胚胎心率为处理36 h时测得。同列无相同字母表示差异显著(P<0.05)。

2.3 BPA对仔鱼期稀有鮈鲫的毒性效应

BPA暴露导致稀有鮈鲫仔鱼心包水肿，心率不齐，鳔形成率下降(图2)。空白组仔鱼发育正常无畸形，而BPA暴露组则出现了不同程度的畸变。

A，空白组仔鱼心包和鱼鳔(SB)发育正常；B，心包水肿(PCE)；C，鱼鳔未充气；D，心包水肿(PCE)、鳔未充气图2 BPA对仔鱼期稀有鮈鲫的毒性效应

对BPA处理组仔鱼的心包面积统计发现，心包水肿面积与剂量成正比，2 mg·L-1BPA处理组仔鱼心包水肿面积与空白组无显著性差异，而4、6 mg·L-1BPA处理组水肿面积显著高于空白组(图3)。BPA暴露显著减弱仔鱼的心脏搏动，仔鱼心率随BPA浓度升高而降低。随着暴露时间增加，空白组仔鱼心率先降低再升高，其他暴露组呈现下降趋势。暴露72 h时，空白组和2 mg·L-1组全部仔鱼鱼鳔充气，4、6 mg·L-1组鱼鳔充气率显著低于空白组。

图3 BPA对仔鱼期稀有鮈鲫心包水肿面积、心率及鱼鳔充气率的影响

3 讨论

BPA对鱼类的毒性作用主要为内分泌干扰和生殖毒性[13-14]。高浓度的BPA暴露会引起胚胎和仔鱼死亡，16 mg·L-1BPA处理组暴露96 h后稀有鮈鲫胚胎死亡率达到100%，8 mg·L-1BPA处理组暴露96 h后稀有鮈鲫仔鱼死亡率达到100%。通过线性回归方程分别求得胚胎和仔鱼的半致死浓度为10.096、4.237 mg·L-1，说明仔鱼期的稀有鮈鲫对BPA的毒性反应更敏感，这可能是因为胚胎期具有卵膜的保护，破膜而出的仔鱼身体稚嫩，直接受到毒物侵蚀引起死亡。

孵化是鱼类生命周期开始的关键，是一系列生物化学和物理学机制联合作用的结果[15]。研究表明，水温25.0 ℃条件下培育稀有鮈鲫胚胎34 h后，心脏发育完全，开始搏动，75 h孵化出仔鱼[7]。本研究发现，BPA能够延迟胚胎发育，表现出延迟发育的特征，可能是BPA影响了孵化酶的合成和释放[13]。物质诱导的心率改变可被视为发育缺陷的表现[16]，无论胚胎还是仔鱼，随着BPA浓度升高，出现心跳减缓和心率不齐等症状。心包水肿的大小同样是衡量心脏毒性的一个重要指标[17]，随着BPA浓度升高和作用时间增加，心包水肿面积增加，表明BPA的暴露影响了心脏的正常生理功能。BPA暴露对胚胎期和仔鱼期稀有鮈鲫的心脏均有毒性效应，造成心脏发育缺陷，影响血液循环，影响营养物质运输，进而造成发育迟缓。

鳔能够增加鱼体的浮力，使鱼在水中自由活动。已有研究表明，光照[18]、水体充气量[19]、水表面的油膜[20]、盐度[21]、温度[22]等均可以引起仔鱼鳔器官发育异常。本试验中，BPA暴露72 h后，除空白组和2 mg·L-1BPA处理组外，其余BPA暴露组鳔充气率均显著降低。