不同剂量三参饮改善干燥及NOD小鼠颌下腺PD-1及PD-L1高表达情况①

陈月月 汪 悦 钱冬晨 何 静 郭 亮 徐媚媚 胡 伟 徐 蕾

(南京中医药大学第三附属医院，南京 210001)

干燥综合征是以口干、眼部干燥等为主要表现，伴多系统损害的系统性自身免疫性疾病[1-4]。在我国其发病率高，临床表现较白种人严重[1，2]。现有的治疗方法以免疫抑制剂及生物毒性药物为主，临床效果有限，价格昂贵，常伴有严重的并发症[1]。相较于西医，中医治疗长期临床效果稳定、副作用少、价格经济。因此，干燥综合征的中医治疗逐渐被临床接受。文献报道，pSS是在多因素的作用下引起机体 CD4+T 细胞异常活化，释放多种细胞因子和炎症介质；同时，活化的CD4+辅助性 T 细胞又可促进 B 淋巴细胞分化为浆细胞，分泌大量病理性自身抗体，导致外分泌腺和腺外器官的损伤。研究显示PD-1 信号的异常与类风湿性关节炎、多发性硬化及系统性红斑狼疮相关，已成为免疫性研究的热点[4]。Kobayashi等[5]表明，PD-1/PD-L1通路功能受损可能与抑制淋巴细胞衰竭有关，进而导致pSS。pSS患者体内存在 PD-1、PD-L1和sPD-1 的异常表达，且 PD-1 和sPD-1 与疾病活动度及疾病严重程度密切相关，提示PD-1和sPD-1 或许可作为pSS诊断的临床免疫新指标[6-8]。PD-1/PD-L1共刺激信号异常可能参与了pSS 的免疫病理损伤进程，其具体机制尚待进一步研究。国家级名中医刘永年教授提出了流津润燥法治疗干燥综合征理论。该理论提出，部分患者多不欲饮或渴不多饮，或见浮肿便溏，或有脉络瘀滞之象。该类患者体内并不完全缺乏水液，乃是津液输布障碍所致，证属津液失布。南京市名中医徐蕾教授在该理论基础上开发出“三参饮”浓煎剂，临床取得了满意疗效。该方由玄参、麦冬、沙参、女贞子、知母、桔梗、紫丹参、木贼草、生甘草等10味药物组成。在治疗上根据病理变化的先后、侧重的不同而灵活施治，将流津润燥寓于补气、温阳、活血、解毒之中，可使气旺津充，瘀去络通，津液输布畅达，燥证得解。

目前，临床上缺乏系统性研究三参饮对于干燥综合征患者疗效的研究，对治疗剂量尚无相应临床研究数据供参考。因此，本研究观察了不同剂量三参饮治疗干燥综合征患者的疗效。同时，通过监测不同剂量三参饮治疗后干燥综合征动物模型颌下腺中PD-1 及PD-L1表达[6，7]，进一步探求三参饮作用机制。

1 资料与方法

1.1研究对象 自2013年4月至2018年4月，在我院就诊的原发性干燥综合征患者共110例，年龄18～75岁，在取得患者及家属知情同意后进入本研究，本研究已通过我院伦理委员会审查。此后将患者，随机分为3组，在正规西医治疗同时，辅以不同剂量的三参饮，分为高剂量组[4.20 ml/(kg·d)]、中剂量组[2.10 ml/(kg·d)]和低剂量组[1.05 ml/(kg·d)][9]。患者根据剂量每日服用1剂，分3次口服，共4周。

高剂量组、中剂量组及低剂量组患者分别为38例(男20例，女18例)、35例(男17例，女18例)、37例(男19例，女18例)；各组平均年龄分别为(40.4±6.4)岁、(42.0±5.7)岁、(41.2±6.1)岁。

1.2病例入选标准

1.2.1西医诊断标准[9]： (1)存在1项或以上的如下的口腔症状，包括持续3个月以上每日均感到口干，腮腺反复或出现持续的肿大(成人后)，无法在无饮水情况下吞咽干性食物。(2)存在1项或以上的如下的眼部症状，包括持续3个月每日均感到无法忍受的眼干，眼部有磨砂感或自觉眼中反复有沙子进入，每日均需次数在3次或以上使用人工泪液对眼部进行湿润。(3)存在1项或以上的如下的眼部体征，包括SchirmerⅠ试验阳性，角膜染色阳性。(4)组织学检查提示有1个及以上的下唇腺病理淋巴灶。(5)存在1项或以上的如下的颌下腺受损指标，包括唾液流率≤1.5 ml/15 min，腮腺造影阳性，颌下腺放射性核素检查阳性。(6)自身抗体检测提示抗SSA或抗SSB阳性。

在排除头、颈部、面部放疗史、AIDS、淋巴瘤、HBV、结节病、GVH病、使用抗乙酰胆碱药物情况后，并在无任何潜在疾病的情况下，在包含了(4)和/或(6)条的情况下，满足了4点或以上上述诊断后可诊断干燥综合征；此外，若满足了(3)～(6)点中的任意3点，亦可诊断为原发性干燥综合征。

1.2.2中医诊断标准[9]患者需符合燥痹、气阴两虚证。首先，燥痹需有：(1)可有禀赋不足，阴液失充等，女性多见。(2)主症：以少津、口干、少泪、眼干为主要症状。(3)次症：伴有皮肤干燥、少汗、咽干、关节疼痛、气短、胸闷等症状。(4)舌质呈红色或绛红色，可有裂痕，或花剥；脉细数或弦细数，或细涩。(5)辅助检查：提示浅表性角膜炎、角膜内有小血管形成，可伴有云翳或者溃疡；舌细带唾液缺如，颌下腺在按摩后无唾液分泌，无腮腺肿大；血红蛋白减少、白细胞减少、嗜酸性粒细胞或淋巴细胞百分比轻度增高，血沉增快；白蛋白降低、球蛋白增高；抗SSA抗体、抗SSB抗体阳性，抗核抗体阳性，类风湿因子阳性，IgG、IgM增高；下唇小颌下腺组织活检，提示2级以上。若具备1项及以上主症，3项或以上次症，综合舌、脉情况以及相应辅助检查结果可确诊。其次，气阴两虚证需有：神疲、乏力，懒言，头晕目眩，心悸、胸闷，气短，面色淡白或面色萎黄，唇、甲色淡，手、足麻木等证。

1.2.3排除标准 继发性干燥综合征；原发性干燥综合征但已有严重多脏器损害者；长期使用免疫抑制剂等药物；严重的心、脑血管疾病、肝、肾、血液系统等疾病，影响患者生存情况的严重疾病患者；妊娠、哺乳妇女；体质过敏、对治疗药物过敏者；长期药物、酒精滥用者，吸毒者。

1.3观察评价指标

1.3.1临床表现评价标准

1.3.1.1干燥综合征包括眼部和口咽部主要症状评价标准[9]轻度(2分)患者口咽部症状表现为津少咽干较轻，少量饮水即可缓解，唇红而干；眼干不适，灼热而痒， 少泪，偶有瞬目，每日点人工泪液1～3次即可。

中度(4分)患者口咽部症状表现为津少咽干较著，需经常饮水，吃干食觉不适， 有时口舌溃疡，起皱皮，唇赤而干；眼部症状表现为眼干不适，灼热而痒、涩痛或刺痛，但可忍受，少泪，频繁瞬目， 每日点人工泪液4～6次。

重度(6分)患者口咽部症状为咽干津燥严重，频繁饮水， 干食难下，而汤水冲服， 常有口舌裂溃疡，起皱皮 如皲裂，唇暗红干或裂；眼部则患者常感眼内异物不适感，干涩灼热痒痛、刺痛难忍，泪极少或无泪，频繁瞬目，每日点人工泪液 6 次以上。

1.3.2干燥综合征次要临床表现评价标准[9]轻度(1分)患者偶有轻度疲劳感，伴偶发低热；鼻腔略有干燥；舌红少津，或舌略有紫气；偶有腮腺或颌下腺肿伴压痛，2周内可消退；皮肤轻度干燥有轻度痒感；大便干燥，排便不畅， 一般1日1次；患者关节边缘或触及韧带时重压，患者称有压痛，被动活动不受限。此外，女性患者阴道轻度干燥，但不影响性交。

中度(2分)的患者则表现为有疲劳感，活动后疲劳感明显，静息时亦有乏力疲劳感；常有低热，每次持续时间小于15日；鼻腔症状表现为干燥明显，有燥热感，偶有少量鼻血；舌红苔少或少量剥脱，或有紫气紫点；常有腮腺或颌下腺肿，伴痛、压痛，2周以上不能消退；皮肤干燥起屑、瘙痒不适；大便干结不畅，一般2～3日1次；重压患者关节，患者称有痛，且皱眉头表示不适，被动活动轻度受限；女性患者阴道干燥，对性交有一定影响。

重度(3分)的患者疲劳感明显，静息时亦有疲劳感；常有低热，持续时间大于15日；患者鼻腔干燥灼热，常有鼻血， 血量较多；舌干红无苔或较多剥脱， 舌暗红或紫气或紫斑；腮腺或颌下腺肿大疼痛不消，甚或伴发热；皮肤干燥有裂、瘙痒明显，皮屑多；大便干结难解，3 日以上 1 次，常需用泻药帮助排便；重度压痛，重压患者称有压痛，且退缩逃脱，被动活动严重受限；女性患者阴道干燥，性交非常困难。

1.4临床疗效评估方法 临床疗效根据疗效指数[10]及治疗后临床表现进行综合评估，以此鉴定三参饮临床疗效。

疗效指数=100%×(治疗前临床表现评分-治疗后临床表现评分)/治疗前临床表现评分[10]。

缓解明显患者其临床症状及体征基本消失(疗效指数 95%)；缓解较显著患者临床症状及体征改善明显(95%>疗效指数 70%)；有一定效果指患者症状和体征有好转(70%>疗效指数 30%)；无临床效果患者则表现为症状、体征无改善，甚至有所加重(疗效指数<30%)[10]。

1.5三参饮治疗期间不良反应评估 根据三参饮临床治疗期间的不良反应进行评估，可以了解该治疗安全性，为今后临床应用提供安全性评价指标[10]。

根据受试者主观感受、是否影响治疗进程以及对受试者健康所造成的客观后果等方面，将不良反应的严重程度分为以下3种[10]：(1)轻度不良反应：受试者可忍受，不影响治疗，不需要特别的处理，对受试者康复无影响。(2)中度不良反应：受试者难以忍受，需要撤药或做特殊处理，对受试者康复有直接影响。(3)重度不良反应：危及受试者生命，致死或致残，需立即撤药或做紧急处理。

1.6采用干燥综合征模型鼠评估颌下腺上PD-1及PD-L1表达检测 取6～7周雄性NOD小鼠[11，12]共40只，购于北京维通利华公司实验动物中心，许可证号:SCXK(京)2011-0011。将小鼠随机分4组，分别为空白对照组(Control group,CG)、低剂量组(Low-does group,LG)、中等剂量组(Middle-dose group,MG)及高剂量组(High-dose group,HG)，按照人鼠等效计量，分别予以6.7 ml/(kg·d)，13.3 ml/(kg·d)，26.7 ml/(kg·d)三参饮灌胃，持续4周。心脏采血，后将小鼠脱颈处死，并取颌下腺组织生理盐水冲洗后固定在10%福尔马林溶液中，常规脱水、石蜡包埋、切片。而后将颌下腺的石蜡切片进行常规的脱蜡、脱水处理，并予双蒸馏水冲洗从而暴露抗原，而后予以过氧化氢处理，而后行免疫组化分析，予以二氨基联苯胺显色，苏木精染细胞核。阴性对照采用正常小鼠IgG代替一抗，余操作相同。免疫组化中所用抗体来自美国Ebioscience公司。结果根据McCarthy半定量方法根据在颌下腺中的染色强度分为：无染色：0分；弱阳性染色：1分；中度阳性染色：2分；强阳性染色：3分。

2 结果

2.1临床效果 主要症状评价:三参饮可以明显改善患者口咽部及眼部的干燥情况；予以高剂量的三参饮治疗患者其临床症状改善更加明显。详见表1。

2.2次要症状评价 三参饮辅助治疗前后次要症状均明显改善，同时，高剂量组中改善明显。详见表2。

2.3总体疗效评价 高剂量组患者治疗总体疗效明显改善，总体有效率明显增高，且组间比较差异有统计学意义。见表3。

2.3不良反应发生情况 治疗过程中无不良反应发生。

2.4干燥综合征模型小鼠(NOD小鼠)评估颌下腺上PD-1及PD-L1表达检测 干燥综合征模型小鼠颌下腺标本免疫组化切片提示予以三参饮治疗后PD-1及PD-L1表达相较于空白对照组降低(详见表4，图1、2)。予以Mann-W hitney U检验，提示Z=-2.872，P<0.05，即予以高剂量三参饮治疗，PD-1及PD-L1降低程度较低剂量组显著。详见表4。

表1 各组间治疗前后主要症状评价Tab.1 Improvement of main clinical symptoms in different group

Note：There is a significant difference between before and after treatment,1)P<0.05;the significant difference could be found among different groups,2)P<0.05.

表2 各组间治疗前后次要症状评价Tab.2 Evaluation of secondary symptom evaluation improvement

Note：There is a significant difference between before and after treatment,1)P<0.05；the significant difference could be found among different groups,2)P<0.05.

表3 各组间治疗前后总体评价Tab.3 Conclusion evaluation after treatment

Note：The significant difference could be found among different groups,1)P<0.05.

图1 治疗后小鼠颌下腺PD-1的表达(IHC,×400)Fig.1 Expression of PD-1 in mice′s submandibular glands after treatment (IHC,×400 )Note: A.CG;B.LG;C.MG;D.HG.

图2 治疗后小鼠颌下腺PD-L1的表达(IHC,×400)Fig.2 Expression of PD-1 in mice′s submandibular glands after treatment (IHC,×400 ) Note: A.CG;B.LG;C.MG;D.HG.

表4 不同剂量三参饮治疗后PD-1及PD-L1表达情况Tab.4 Expression of PD-1 and PD-L1 in submandibular gland after treatment

Note：The significant difference could be found among different groups,1)P<0.05.

3 讨论

干燥综合征是以累及外分泌腺(颌下腺、泪腺等)为主，以高度淋巴细胞浸润为主要特征的系统性自身免疫性疾病，分原发性及继发性，临床表现多样，以口干、眼部干燥等为主要表现[1]。现对治疗多使用免疫抑制剂和生物制剂行全身性药物治疗[1-3]。相比于西医，中医治疗长期临床效果稳定、副作用少、价格经济；因此，逐渐被临床接受。

根据《内经》对燥症以及燥邪伤人的论述，如口干、眼睛干燥、刺痛、皮肤干燥、伴有乏力、关节及周身疼痛等症状；现大多数中医学家将其归为燥症的范畴，并提出津液亏损、阴虚致燥为该疾病的基本中医病理基础[4，5，13-15]。目前中医治疗上，多以达到润燥、活血、生津、养阴为主。

本研究通过不同剂量的三参饮对干燥综合征患者进行辅助治疗，患者临床症状明显改善；高剂量组患者临床症状改善更加明显，提示三参饮有明显临床效果。

此外，目前认为干燥综合征作用机制与CD4+T细胞及B细胞的非正常激活有关[8]。PD-1及PD-L1作为负性共刺激因子，除可诱导T细胞凋亡外，还可以阻止T细胞对白介素-2及干扰素-γ的分泌；二者的表达水平与系统性自身免疫性疾病密切相关。已有研究表明，通过治疗，干燥综合征患者除症状改善外，血液及唇腺组织中的PD-1及PD-L1表达也可显著降低[8]。此外，该研究通过对干燥综合征鼠模型，予以不同剂量三参饮治疗，比较小鼠颌下腺PD-1及PD-L1表达情况，发现予以三参饮治疗小鼠其颌下腺中与自身免疫性疾病相关的PD-1及PD-L1表达量降低，该降低程度与治疗剂量呈正比。提示三参饮可能通过调节机体系统免疫发挥作用，该结果对研究三参饮作用机制提供方向。