替吉奥下调大鼠胃癌前病变组织Notch1和Jagged1的表达

王英杰 王 晶

(承德医学院，承德 067000)

胃癌现在已经成为全世界都关注的健康问题，截至目前，胃癌的发病人数仍以每年90多万例的数量持续增加，并且每年的死亡人数也达到了70多万例，占据了全球死亡人数的第二位[1]，给人们的健康生活以及经济都带来了巨大的损失，是消化道最多见的恶性肿瘤。在中国，其发病率占消化道恶性肿瘤的首位，约占世界发病率的52%。针对胃癌，目前最有效的治疗措施就是根治性的切除手术，但是由于胃癌的早期发病症状并不十分明显，所以大多数患者在发现病情时就已经错过了最佳的治疗时间。而对于晚期的胃癌患者，化疗是最有效的延长患者生命的治疗手段[2]。所以认识胃癌的发病机制，对于胃癌特异性抗癌药物的研发和胃癌的治疗都具有重要意义。

Notch信号通路在胃癌的整个发生过程中都起到了重要的作用，这其中就包括Notch信号通路出现表达升高时，胃腺上皮细胞会出现大量的增殖，进而引起凋亡下降，然后由于上皮表型的恶性转化致使癌变发生[3]。已有学者在胃癌的研究中发现，Notch的配体Jagged1和人体的侵袭型胃癌具有密不可分的关系[4]。胃癌组织Jagged1表达上升的患者的生存率比无Jagged1表达的患者低[5]。学者们发现NF-κB的过量表达，能够造成Notch信号通路失调介导，是导致胃癌发生、发展的主要机制[6]。本实验通过建立大鼠胃癌模型，使用替吉奥对其进行干预治疗，检测Notch信号通路的相关蛋白表达，为临床治疗提供可靠的实验和理论基础。

1 材料与方法

1.1材料 实验室用动物：选用健康的雄性清洁级大鼠，6～8周龄，重量220～240 g。所有实验用的大鼠均购于北京维通利华动物公司，大鼠取回后能够自主地进食进水，动物存放室的温度一般控制在(25±2)℃左右，湿度大约在(40±5)%左右，在进行动物实验之前要按照SPF级的动物准则喂养5～7 d。替吉奥购自山东新时代药业有限公司，琼脂糖和RIPA购自Yeasen公司，β-actin购自Santa cruiz公司，N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍(N-methyl-N′-nitro-N-nitrosog-uanidine,MNNG)购自湖北远成赛创公司。

1.2方法

1.2.1实验动物模型建立 用100 μg/ml的MNNG混悬液进行灌胃，混悬液里药品浓度为：2 ml/100 g 体重，每间隔1 d进行1次，持续灌胃30 d，并且每3 d使用1.5 ml的纯乙醇强行进行灌胃，在进食2 d后断食1 d，在断食的同时要保证大鼠自主服用20 mmol/L的脱氧胆酸钠溶液，每5～7 d 使用夹子擒住大鼠尾部1～2次，这能够让大鼠保持一个相对亢奋的情绪，每次刺激持续10 min，连续进行4周；以上的每个实验组均喂养4周。并于制作模型完成之前随机选取每组大鼠6只给予胃黏膜的病理形态学检查，在这6只被检测鼠中，只要5只大鼠出现有轻、中度的非典型增生，就可以认为是制作模型成功。将60只大鼠随机取等分为3组：对照组、模型组、替吉奥治疗组。替吉奥治疗组给予替吉奥治疗，用药量0.5 mg/g。

1.2.2大鼠胃组织的取材 观察大鼠的精神状态、活动度、毛发光泽度、摄食及死亡情况。每周称2次体重，观察体重变化。给药第85天，所有大鼠用10%水合氯醛(0.3 ml/100 g体重，腹腔注射)麻醉大鼠后，将大鼠的胃取出，然后沿着胃的大弯将胃慢慢剪开，这个操作的顺序是：胃底、胃体、小弯、幽门、贲门处分别取材，4%中性甲醛固定。

1.2.3PCR检测Notch1和Jagged1的基因表达 组织总RNA的提取：取膀胱组织约100 mg，将组织剪碎后放入到匀浆器内，加入1 ml预冷的Trizol，将组织打碎，装入1.5 ml EP管中；加入300 μl的氯仿，充分混匀，12 000 r/min，4℃离心15 min；抽取上层水样400 μl转移到清洁的EP管中，加入400 μl异丙醇，12 000 r/min，4℃离心15 min，离心结束后缓慢将上清倒掉，留取沉淀物；使用预冷的75%乙醇，清洗1次，然后7 000 r/min，离心5 min；使用无酶枪头，将75%乙醇吸净，室温的状态下静置5～7 min，使乙醇充分挥发，剩余的沉淀加入25 μl RNase-free水进行溶解。

PCR扩增：PCR反应体系体积为50 μl，反应体系内容含有：反应缓冲液、Taq DNA聚合酶、dNTPs、上下游引物及逆转录反应产物cDNA等，其中上下游引物各1 μl，模板cDNA为3 μl。加样完成后振荡混匀，瞬时离心后，置于PCR仪扩增。建议反应条件为：94℃变性20 s，55℃退火30次，72℃延伸30 s，循环30次，72℃延伸30 s。

扩增产物琼脂糖凝胶电泳：使用1%琼脂糖凝胶，用Gelstain染料和凝胶成像系统显色并采集图片。使用IPP图像分析软件进行半定量分析测定，测量条带灰度值，目的条带与GAPDH条带灰度值比值即为该目的基因的相对表达水平，引物见表1。

1.2.4Western blot检测Notch1、Jagged1的蛋白定量 将获取的大鼠胃组织从-80℃超低温冰箱中取出，然后将胃组织剪碎，按照100 mg/ml的比例加入裂解液，12 000 r/min低温离心15 min，然后SDS-PAGE电泳分离后，转移至 PVDF膜上。5%脱脂奶粉 37℃ 封闭 1.5 h，一抗孵育，并在4℃环境下过夜，第2天二抗孵育2 h。用ECL显色液进行曝光，使用Image J软件进行分析，以β-actin作为内参进行半定量分析。

2 结果

2.1实验大鼠的基本生理数据 对照组中的大鼠进食多，肥胖，灵活，毛色光亮；模型组与对照组相比大鼠出现消瘦，不爱活动，毛色灰暗，进食少，大便稀溏；替吉奥组大鼠与模型组大鼠相比食量正常，背毛光泽度欠佳，体重增加，大便成形，见表2。

2.2PCR检测结果 应用PCR实验的方法检测的结果显示，在对照组中，Notch1和Jagged1 mRNA仅有少量的表达。与对照组相比，模型组表达均上升(P<0.05)。与模型组相比，替吉奥组表达显著地下降，但是仍高于对照组的表达(P<0.05)，见图1、表3。

表1 PCR引物序列Tab.1 PCR primers

表2 各组大鼠的体重指标Tab.2 Body weight of rats in each group

图1 PCR检测各组Notch1和Jagged1的表达Fig.1 Detection of mRNA expression levels of Notch1 and Jagged1 in gastric tissue of mice in each group by PCR

表3 PCR 检测Notch1和Jagged1在各组中的相对定量表达Tab.3 Relative expression detection of mRNA levels of Notch1 and Jagged1 in gastric tissue of mice in each group by PCR

Note：Compared with control group,1)P<0.05；compared with model group，2)P<0.05.

2.3Western blot检测结果 Notch1的分子量是120 kD，Jagged1的分子量是150 kD。Notch1和Jagged1的Western blot检测结果显示，在对照组中，Notch1和Jagged1蛋白仅有微量的基础表达，与对照组相比，模型组的蛋白表达均显著地上升(P<0.05)，与模型组相比，替吉奥组的蛋白表达下降，但是仍高于对照组的表达(P<0.05)，见图2、表4。

图2 Western blot检测各组Notch1、Jagged1的表达Fig.2 Detection of Notch1 and Jagged1 protein in gastric tissue of mice in each group by Western blot

表4 Western blot 检测Notch1和Jagged1在各组中的相对定量表达Tab.4 Relative expression detection of Notch1 and Jagged1 protein in gastric tissue of mice in each group by Western blot

Note：Compared with control group,1)P<0.05；compared with model group，2)P<0.05.

3 讨论

胃癌的发病是一个很复杂的过程，这其中有细胞的增殖等方面的参与，是一个多发因素共同作用的结果[7]。平时不健康的饮食习惯、幽门螺杆菌的感染、基因性质的改变都会成为胃癌发生的诱因。胃癌的发生发展是从胃黏膜良性病变向恶性病变逐步演变的过程，也就是说，是由慢性萎缩性胃炎到胃黏膜癌前病变的过程。近年国内外对胃癌的研究热度都呈现上升的趋势，这也说明人们对胃癌的重视程度在逐渐地加深[8]。

替吉奥最早是由日本医药公司研制，并于20世纪末上市[9]。它的适用范围是胃癌及头颈部癌。截至目前，替吉奥在日本已经是治疗晚期胃癌不可或缺的主要力量。替吉奥在2009年才在中国研发成功[10]。在替吉奥出现以前，氟脲嘧啶在处理消化道肿瘤过程中占据主导位置。但是由于其半衰期比较短，这就在很大程度上降低了氟脲嘧啶的抗癌作用效果，因此在临床实际使用过程中，通常采用静脉滴注的方式来延长氟脲嘧啶的药效，这一弊端导致氟脲嘧啶在临床的实际使用中出现了很大的局限性。针对这一问题，替吉奥胶囊成为新一代的氟脲嘧啶类口服抗癌药物，他的出现将完美地弥补氟脲嘧啶半衰期短的弱点。

本实验采用体内灌胃法建立大鼠胃癌前病变模型，相对真实地模拟和还原了胃癌在临床中的实际发病过程。然后将大鼠胃组织从体内分离出来，进行蛋白定量和基因方面的检测。PCR检测结果显示，治疗组Notch1和Jagged1 mRNA的表达与模型组相比明显下降，这也表明替吉奥的药物治疗发挥作用；Western blot检测结果显示，治疗组蛋白的表达相比与模型组显著地下降，这也进一步说明了替吉奥对胃癌前病变的治疗发挥了作用。

综上所述，本实验通过制备大鼠的胃癌模型，采用替吉奥进行干预治疗，得到了显著的治疗效果，为临床治疗提供了实验以及理论依据。