甘草酸对LPS诱导的IEC-6细胞NF-κB通路及炎症因子表达的影响①

罗 敏 肖婷婷 曾 星 张 娴

(广州中医药大学第二附属医院，广州 510120)

甘草酸(Glycyrrhizic acid，GA)又名甘草甜素，是豆科植物甘草根部提取物中最主要的活性成分。现代药理研究表明甘草酸具有抗炎、抗溃疡、抗过敏、抗氧化、皮质激素样作用等生物学特性[1]。研究发现甘草酸对脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)诱导的肠上皮细胞IEC-6炎症模型具有潜在的保护作用，其抗炎机制可能与抑制炎症因子释放和干预炎症信号通路密切相关[2，3]。既往研究表明，甘草酸能够调节LPS刺激的IEC-6细胞炎症因子IL-6、TNF-α表达，减轻该细胞的炎症性损伤，具有一定的抗炎作用[4]。在此，通过构建LPS诱导的IEC-6细胞炎症模型，进一步观察甘草酸对LPS诱导活化Toll样受体4(Toll like receptor 4，TLR4)/NF-κB信号通路的干预作用，以明确甘草酸抑制IEC-6细胞炎症损伤的细胞因子表达调控的分子机制。

1 材料与方法

1.1实验材料 大鼠IEC-6细胞购自美国标准生物品收藏中心；甘草酸购自Fluka公司；LPS购自Sigma公司；高糖DMEM培养基、胎牛血清、0.25%胰酶消化液购自Gibco公司；RIPA蛋白提取试剂、兔抗NF-κB p65、p-IκBα、IκBα、环氧合酶2(Cyclooxygenase 2，COX-2)、诱导型一氧化氮合酶(Inducible nitric oxide synthase，iNOS)抗体购自CST公司；TRIZOL购自Invitrogen公司；BCA蛋白定量试剂盒和胞浆胞核试剂盒购自Thermo Scientific公司；逆转录试剂盒、荧光定量PCR试剂盒购自德国Roche公司；5×蛋白上样缓冲液购自碧云天公司；TLR4、MyD88、GAPDH抗体购自Santa公司；LaminB1、α-tubulin、细胞间粘附分子-1(Intercellular adhesion molecular-1,ICAM-1)、CD14、IL-6、IL-10抗体购自Proteintech公司；Western blot所用试剂及分子标准购自美国Bio-Rad公司。

1.2实验方法

1.2.1细胞培养及处理 将大鼠的IEC-6细胞用含10% FBS、0.1 U/ml胰岛素的DMEM于37℃、5%CO2恒温培养箱培养，待细胞融合度达80%时，用0.25%胰酶消化传代。实验设立Control组、LPS组、LPS+GA组、GA组，细胞接种贴壁后，Control组正常培养，GA组和LPS+GA组加入100 μg/ml的药物作用24 h后，与LPS组一起加入10 μg/ml的LPS作用4 h后收集细胞用于后续实验。

1.2.2细胞蛋白提取及Western blot法检测蛋白表达水平 按上述细胞分组处理后收集细胞，弃上清，用4℃的PBS清洗2次。分别按照RIPA和胞浆胞核蛋白提取试剂盒说明书提取总蛋白、胞浆蛋白及胞核蛋白，BCA法蛋白定量变性后进行SDS-PAGE电泳、转移至PVDF膜、5%脱脂奶粉封闭以及相应一抗4℃孵育过夜，二抗摇床孵育1 h，ECL化学发光显影，应用成像分析系统进行条带扫描分析结果。细胞总蛋白以GAPDH为内参，细胞浆蛋白以α-tubulin为内参，核蛋白以LaminB1为内参，应用Image J软件进行条带灰度分析，即可得到目的蛋白与对应内参蛋白之间的灰度值之比，并进行组间比较。实验独立重复3次。

1.2.3RT-qPCR检测mRNA表达 Trizol裂解收集细胞，提取总RNA，逆转录合成cDNA，然后进行程序扩增，检测各处理组细胞内TLR4、IL-6、IL-10的mRNA表达水平，引物序列见表1。

2 结果

2.1GA对LPS诱导的IEC-6细胞中TLR4信号通路相关膜蛋白分子TLR4、CD14、MyD88蛋白表达以及IκBα磷酸化的影响 Western blot结果如图1所示，与Control组相比，LPS模型组TLR4、CD14、MyD88蛋白表达和p-IκBα磷酸化水平升高，差异具有统计学意义(P<0.05)。与LPS模型组相比，LPS+GA组与GA组能显著逆转这些蛋白的表达水平(P<0.05)。

2.2GA对LPS诱导的IEC-6细胞中NF-κB p65核转位的影响 上述结果显示GA可以显著抑制CD14、TLR4蛋白表达及IκBα的磷酸化水平，进一步检测NF-κB p65在细胞浆及细胞核的表达发现，与Control组相比，IEC-6细胞在LPS刺激下，核内NF-κB p65蛋白分布显著增高，明显高于Control组，GA干预后可显著降低其表达(图2，P<0.05)。而NF-κB p65总蛋白并没有明显变化，差异无统计学意义(图2，P>0.05)。

表1 Real-time PCR引物序列Tab.1 Primer sequence of Real-time PCR

图1 GA对LPS诱导的IEC-6细胞中TLR4、CD14、MyD88蛋白表达以及IκBα磷酸化的影响Fig.1 Effect of GA on expression of TLR4，CD14，MyD88 proteins and phosphorylation of IκBα in LPS-induced TLR4 signaling pathways of IEC-6 cellsNote: Compared with Control group，*.P<0.05，**.P<0.005，***.P<0.000 1；compared with LPS model group，#.P<0.05，##.P<0.005，###.P<0.000 1.

图2 GA对LPS诱导的IEC-6细胞中NF-κB p65核转位的影响Fig.2 Effects of GA on nuclear translocation of NF-κB p65 induced by LPS in IEC-6Note: Compared with Control group， **.P<0.005；compared with LPS model group， ##.P<0.005，###.P<0.000 1.

图3 GA对LPS诱导的IEC-6细胞中ICAM-1、IL-6、IL-10 mRNA表达的影响Fig.3 Effect of GA on mRNA expression of ICAM-1，IL-6 and IL-10 induced by LPS in Note: Compared with Control group，*.P<0.05；compared with LPS model group，#.P<0.05.

图4 GA对LPS诱导的ICAM-1、COX-2、iNOS、IL-6和IL-10的影响Fig.4 Effect of GA on expression of ICAM-1，COX-2，iNOS，IL-6 and IL-10 induced by LPSNote: Compared with Control group，*.P<0.05，**.P<0.005，***.P<0.000 1；compared with LPS model group，#.P<0.05，##.P<0.005，###.P<0.000 1.

2.3GA对LPS诱导的IEC-6细胞中ICAM-1、IL-6和IL-10 mRNA表达的影响 RT-qPCR 结果显示LPS诱导后，IEC-6细胞中ICAM-1、IL-6 mRNA表达水平明显升高，IL-10 mRNA表达水平降低，并与Control组相比差异有统计学意义(图3，P<0.05)。与LPS组相比，GA干预组ICAM-1、IL-6 mRNA表达水平显著下降，IL-10 mRNA水平升高(图3，P<0.05)，差异有统计学意义。

2.4GA对LPS诱导的IEC-6细胞中ICAM-1、COX-2、iNOS、IL-6和IL-10蛋白表达的影响 Western blot结果如图4所示，相对于Control组，LPS组ICAM-1、COX-2、iNOS、IL-6蛋白表达均明显上调以及IL-10的蛋白表达量降低(P<0.05)，与LPS相比，GA干预能显著逆转这些蛋白的表达水平，差异具有统计学意义。表明GA能影响NF-κB信号通路的活化以抑制炎症基因的表达。

3 讨论

LPS又称为内毒素，是革兰氏阴性菌的致病因子。正常生理情况下，肠道存在精确的负性调控机制使得肠上皮细胞与肠道高浓度的细菌保持共生状态，而在病理状态下，大量肠道内细菌和LPS直接接触肠黏膜上皮细胞，可引起不同的肠道病理改变和炎症损伤。CD14是第一个被鉴定为LPS受体的蛋白，通过识别结合LPS/LPB(LPS binding protein)复合物来介导LPS的免疫反应[5]。TLR4是识别LPS的关键上游受体，控制着LPS炎症信号的细胞内转导。在典型情况下，TLR4活化后CD14将LPS转移至TLR4/髓样分化蛋白2(Myeloid differentiation protein 2，MD-2)复合物中[6]。NF-κB是肠道炎症和免疫反应中的关键转录因子，通常以二聚体亚基(p65及p50)与其抑制物IκB结合形成三聚体，并以无活性形式存在于细胞浆中[7]。TLR4被激活后的自身二聚化与MyD88结合，诱导IκB激酶即从无活性状态转为活性状态，催化IκBα磷酸化降解，释放的NF-κB暴露出p50 亚基上的易位信号和p65 亚基上的DNA 结合位点，借助p50由胞质转入胞核内，借助p65与相应靶基因中的启动子或增强子κB位点结合，从而诱导IL-6、TNF-α等炎症因子的表达。

Western blot检测结果显示IEC-6细胞在LPS刺激后TLR4、CD14、MyD88 和p-IκBα蛋白表达增高，p65核内分布明显增多，而甘草酸能阻止LPS诱导IEC-6细胞NF-κB通路的激活，减少p65的核转位。Wang 等[8]报道用甲氨蝶呤诱导的肠炎性大鼠中，甘草酸可通过降低NF-κB p65 和 p38MAPK表达水平以预防肠炎发生。

ICAM-1属于免疫球蛋白超家族成员，广泛参与炎症和免疫反应[9]。ICAM-1在正常肠组织中呈低水平表达，而在炎症状态下，ICAM-1的表达水平迅速上调， NF-κB可以和ICAM-1基因启动子区的转录因子结合位点相互结合促进ICAM-1的表达，这与我们研究结果一致。我们还发现甘草酸预处理能够显著降低LPS刺激IEC-6细胞中ICAM-1的水平，正如Wang等[10]报道甘草酸能够有效抑制单核细胞趋化蛋白-1和ICAM-1的表达，从而在糖尿病小鼠肾脏中发挥抗糖尿病作用。另外，ICAM-1缺陷小鼠在用3%葡聚糖硫酸钠诱导的急性实验性结肠炎模型中表现出更低的死亡率，并且炎性细胞浸润和肠道损伤减少[11]，这提示ICAM-1可能在急性肠道炎症的发展中发挥关键作用。所以本实验从另一个角度证实甘草酸可能是通过抑制ICAM-1的表达而减缓因各种因素造成的肠道炎症性损伤。iNOS和COX-2是启动子含NF-κB结合位点的两种诱生型酶，也是介导炎症过程的重要酶。在大多数正常状态下不表达，而在炎症时高度表达，分别催化一氧化氮(Nitric oxide，NO)、前列腺素E2(PGE2)的大量合成。现有研究表明，真核转录因子NF-κB参与调控iNOS和COX-2的表达。Zhao等[12]报道甘草酸通过抑制NF-κB信号通路的激活、抑制肾组织中NO和PGE2的产生以及降低iNOS和COX-2的表达水平，进一步缓解败血症诱导的大鼠急性肾损伤，显著提高急性肾损伤大鼠存活率。此外，Wang等[13]研究显示甘草甜素能够显著减弱小鼠子宫内膜上皮细胞中NF-κB的活化，同时LPS诱导的iNOS和COX-2表达被甘草甜素抑制，故甘草甜素可发展为治疗子宫内膜异位症的潜在药剂。此外，已有大量研究表明[14-16]，甘草酸能够通过干预多个炎症信号通路来减少或抑制炎症因子的释放，从而减轻LPS所导致的炎症损伤。本实验结果也表明，LPS组中iNOS和COX-2的表达水平显著增加，而甘草酸干预后能够减弱LPS诱导的IEC-6细胞中iNOS和COX-2的表达。同时本研究结果显示甘草酸能抑制促炎性细胞因子IL-6分泌，增加抗炎性细胞因子IL-10分泌。

综上所述，甘草酸能通过抑制LPS诱导的TLR4/NF-κB信号通路的活化以阻断调控炎症因子及相关蛋白的合成，从而达到有效抑制LPS所致的肠上皮细胞炎症损伤。