雌激素调节失血性休克免疫功能的作用与机制①

王 鹏 李曙光 赵自刚

(河北北方学院微循环研究所，张家口 075000)

研究显示，世界范围内，每年约有580万人由于创伤相关事件死亡，创伤成为所有年龄段人群死亡和残疾的主要原因之一，约40%的创伤相关死亡是由于出血或并发症[1]。失血性休克引起免疫功能抑制，使机体抗感染能力下降，成为失血发展为全身感染的一个关键环节[2]。雌激素具有广泛的生物学活性，依赖于雌激素受体(Estrogen-receptor，ER)及其配体或相关蛋白发挥作用[3]。1996年，Wichmann等[4]首次发现失血性休克雌性小鼠的免疫反应性增强，而雄性小鼠下降，小鼠对脓毒症或感染的易感性表现有性别差异，雌性小鼠对休克有更好的耐受能力。1998年，Angele等[5]报道高睾酮或低17β雌二醇(17β estradiol，E2)抑制了失血性休克后腹腔与脾脏巨噬细胞(Macrophage，Mφ)的功能，参与免疫功能抑制的发生过程。随后的研究显示，E2治疗能改善创伤出血后啮齿动物的免疫功能，减少创伤出血后败血症的发生[6]。这些研究表明，雌激素通过改善免疫功能状态发挥良好的抗休克作用。基于此，本文综述近年来雌激素调节失血性休克免疫功能的研究进展，为扩展雌激素应用于重症失血性休克的临床治疗提供新的思路。

1 雌激素对失血性休克脾细胞损伤的作用与机制

脾脏是机体最大的免疫器官，是细胞免疫和体液免疫的中心，同时还是失血性休克后最容易受损的器官之一。因此，寻找预防和治疗失血性休克后脾脏损伤的措施是防治重症失血性休克及其导致败血症的关键。

Knöferl等[7]发现，失血性休克24 h后，雄性C3H/HeN小鼠脾细胞生成白细胞介素(Interleukin，IL)-2、IL-3水平明显降低，复苏时皮下给予E2治疗使之恢复至正常水平，且降低了抗炎细胞因子IL-10以及小鼠循环血IL-6的水平。进一步发现，去卵巢雌性CBA/J小鼠失血性休克后，脾细胞增殖和干扰素(Interferon，IFN)-γ、IL-2和IL-3释放显著降低，复苏过程给予皮下注射E2治疗恢复了这些细胞因子的释放，体外实验也证实E2可以恢复来自休克小鼠的脾细胞免疫功能[8，9]。Hildebrand等[10]应用8～12周龄雌性C57BL6/J小鼠建立创伤失血性休克模型，发现创伤出血降低了脾细胞产生肿瘤坏死因子(Tumor necrosis factor，TNF)-α、IL-6、IL-10和IFN-γ的能力。创伤出血后在液体复苏的同时，E2和E2联合雄激素受体(Androgen receptor，AR)拮抗剂氟他胺治疗均增加了脾细胞TNF-α、IL-6和IFN-γ的释放，同样对IL-10产生没有显著作用；单独使用氟他胺治疗未见明显作用。以上研究结果表明，E2治疗恢复了创伤出血后脾细胞的免疫功能。

为了进一步明确雌激素对失血性休克脾细胞功能的作用机制，Hildebrand等[11]应用ERβ基因敲除(ER-β-/-)和去卵巢野生型(Wild type，WT)雌性B57BL/J6小鼠建立失血性休克模型，发现创伤出血显著增加了WT和ER-β-/-小鼠血浆TNF-α、IL-6和IL-10含量，复苏时应用E2或ER-α激动剂丙基吡唑三醇(Propyl pyrazole triol，PPT)降低WT和ER-β-/-小鼠血浆TNF-α和IL-6浓度，恢复了脾细胞产生这些细胞因子的功能，但失血性休克后的ER-β-/-小鼠给予E2或PPT治疗后血浆TNF-α和IL-6浓度并未恢复到正常水平。这些发现表明，创伤出血后ER在E2介导脾组织免疫保护作用中均发挥一定作用。

上述研究表明，雌激素可以改善失血性休克后脾细胞的免疫功能，抑制雄激素生成从而促进雌激素发挥有益作用，雌激素对脾细胞的有益作用是通过ER-α和ER-β介导的。研究表明，失血性休克引起了大鼠脾细胞线粒体呼吸功能与氧化磷酸化功能障碍，进一步增加了炎症反应[12]，但雌激素治疗是否有利于恢复脾细胞线粒体功能，还需要研究。

2 雌激素调节失血性休克T淋巴细胞的作用与机制

T淋巴细胞在细胞免疫中具有重要作用，是失血性休克后最常受累的免疫细胞之一。失血性休克后细胞免疫被明显抑制，与患者肺炎和败血症的发生率相关，T淋巴细胞免疫功能抑制增加了失血性休克后败血症的易感性[2，13]。

Samy等[14]研究显示，雄性和雌性小鼠在创伤出血前后，脾T淋巴细胞AR和ER表达均没有差异。雄性小鼠创伤出血后，T淋巴细胞功能降低；氟他胺预处理增加了假手术或创伤小鼠T淋巴细胞ER表达，创伤出血减少了T淋巴细胞IL-6释放以及转录激活因子3(Signal transducer and activator of transcription 3，STAT3)表达，氟他胺预处理使其恢复到正常水平。鉴于AR和ER的反应元件存在于IL-6基因的启动子区域，故将IL-6释放、STAT3表达作为脾脏T淋巴细胞功能的指标，因此这一结果提示氟他胺预处理改善了脾脏T淋巴细胞的免疫功能。Angele等[15]将雄性C3H/HeN小鼠去势后，分别使用含有溶媒、5α-双氢睾酮(5 alpha-dihydrotestoste-rone，DHT-α)、E2或两种激素的组合处理14 d后建立失血性休克模型，发现失血性休克显著抑制了雄鼠以及DHT治疗的去势雄鼠和假手术雌鼠T淋巴细胞Th1细胞因子IL-2、IFN-γ的产生，增加了抗炎细胞因子IL-10的释放。E2治疗、E2+DHT治疗的去势雄鼠和假手术雌鼠均可维持Th1细胞因子释放，E2治疗降低了IL-10释放。说明E2可以调节脾T淋巴细胞Th1细胞因子的释放平衡从而发挥免疫保护作用，体现了雌激素调节失血性休克后脾脏T淋巴细胞功能的重要性。

为了进一步明确雌激素对失血性休克T淋巴细胞功能的作用机制，Samy等[16]的研究发现，创伤出血后，雄性小鼠T淋巴细胞5α-还原酶表达和活性增加，而雌性小鼠T淋巴细胞中芳香化酶活性增加但表达不增加。由于雄性T淋巴细胞5α-还原酶促进了DHT的合成，引起免疫抑制，发情期雌性芳香化酶促进E2合成，具有免疫保护功能，因此，这一结果提示E2对T淋巴细胞功能的保护作用与提高芳香化酶活性有关。随后的研究显示，发情前期小鼠失血性休克后，T淋巴细胞中E2合成增加且转化为雌酮的效率低，去势雌鼠没有这些变化。E2调节T淋巴细胞产生细胞因子IL-2和IL-6的能力依赖于ER以及芳香化酶和17β-羟基类固醇脱氢酶[17]。

Kawasaki等[18]发现E2治疗使失血性休克雄性C3H/HeN小鼠Peyer′s结淋巴细胞数目、细胞增殖、凋亡率、细胞因子产生以及p38丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase，MAPK)和细胞外信号调节激酶(Extracellular signal-regulated kinase，ERK)1/2通路激活正常化，而应用PPT和ER-β激动剂二芳基丙腈(Diarylpropionitrile，DPN)治疗产生了类似的效果，结果提示雌激素对失血性休克后Peyer′s结淋巴细胞的免疫保护作用是通过ER-α和ER-β介导的，其作用机制与调节MAPK激活有关。

Suzuki等[19]研究显示，雄性大鼠经历创伤出血(40 mmHg，90 min)后，液体复苏时分别皮下注射PPT、DPN、E2，24 h后，分离脾T淋巴细胞，发现失血性休克降低了T淋巴细胞产生IL-2和IFN-γ的能力以及p38 MAPK、ERK1/2、c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)、核因子(Nuclear factor，NF)-κB和活化蛋白(Activator protein，AP)-1的活化水平，PPT或E2治疗使这些指标恢复正常，DPN给药无效。进一步发现E2共价衍生物(雌二醇-牛血清白蛋白偶联抗原，17estradiol conjugated to bovine serum albumin,E2-BSA)类似E2抑制了失血性休克降低T淋巴细胞产生IL-2和IFN-γ的能力，但仍然低于假手术组，其对MAPKs活化的抑制作用与E2相同，ER拮抗剂ICI 182780(Faslodex)消除了E2-BSA的作用[20]。

上述研究表明，雌激素对失血性休克后T淋巴细胞功能具有良好的改善作用，其作用机制与芳香化酶活性以及ER-α相关的MAPKs、NF-κB和AP-1信号分子活化有关，且部分作用是通过非基因组作用实现的。

3 雌激素调节失血性休克树突状细胞的作用与机制

树突状细胞(Dendritic cells，DCs)是机体功能最强的抗原递呈细胞，参与固有免疫与适应性免疫的启动，亦是失血性休克后最常受累的免疫细胞之一。研究表明，失血性休克降低了脾DCs的成熟，从而增加了失血性休克后免疫抑制及随后发生败血症的易感性[21]。因此，恢复DCs功能是防治失血性休克后免疫抑制和败血症的关键。Kawasaki等[22]的研究显示，6～8周雄性C3H/HeN小鼠施予失血性休克后显著增加了脾DCs凋亡率，降低了脾DCs细胞因子产生、共刺激因子和主要组织相容性复合体(Major histocompatibility complex，MHC)Ⅱ类分子表达以及抗原呈递能力。液体复苏时给予E2或PPT治疗均逆转了失血性休克的不良作用，相比之下，DPN治疗并未阻止失血性休克对DCs的不良作用。可见，E2改善失血性休克后DCs功能的作用主要通过ER-α介导。除此以外其他的机制还有待进一步观察。

有研究表明，E2可抑制人外周血来源正常DCs的成熟与功能[23]。结合Kawasaki等[22]的结果，说明E2对DCs具有双向调节作用。在失血性休克早期，DCs的成熟加快并且功能增强，体外实验也显示，早期缺氧可增加DCs成熟标志MHCⅡ、CD80表达，这说明DCs在失血性休克或缺氧早期发挥有益免疫功能代偿作用的同时，也是增强炎症反应的机制之一。早期给予E2治疗是否可通过降低DCs成熟与免疫功能，进而避免早期过强的炎症反应及后期的炎症反应失控、免疫功能抑制，从而发挥调节免疫功能平衡的作用是值得关注的。这可能是E2通过调节DCs功能改善失血性休克后免疫功能的一个关键科学问题。

Toll样受体4(Toll-like receptor 4，TLR4)在炎症反应失控的发病学中具有重要作用[24]，将来自TLR4-/-小鼠的DCs输入WT小鼠，显著降低了失血性休克引起的炎症反应及肝、肺组织损伤，说明TLR4表达对于DCs引起的炎症反应具有重要作用[25]，但雌激素治疗是否能降低失血性休克后DCs的TLR4表达，进而发挥早期的抗炎作用尚不清楚。

4 雌激素调节失血性休克Kupffer细胞的作用与机制

Kupffer细胞亦是失血性休克后最常受累的免疫细胞之一，是创伤出血后循环血中促炎细胞因子的主要来源[26]，也是增加失血性休克后败血症易感性的原因之一。

Yokoyama等[27]研究发现，雄性大鼠失血性休克后，Kupffer细胞产生细胞因子IL-6增加，E2治疗以剂量依赖性方式减少失血性休克动物Kupffer细胞产生IL-6的能力，该作用与抑制IL-6 mRNA表达平行。Knöferl等[28]研究显示，行卵巢切除术的雌性小鼠失血性休克后，Kupffer细胞释放TNF-α的含量增加了4倍、血浆TNF-α浓度增加了5倍，而发情前期小鼠Kupffer细胞释放TNF-α和血浆TNF-α浓度没有变化。Frink等[29]研究发现，5α-还原酶抑制剂非那甾胺预处理(2 d)在降低血浆DHT、提高E2水平的同时，显著抑制失血性休克引起8～10周雄性C3H/HeN小鼠血浆以及Kupffer细胞体外产生TNF-α、IL-6、IL-10、角化细胞来源趋化因子、单核细胞趋化蛋白-1、巨噬细胞炎性蛋白-1α的作用，降低了中性粒细胞在肺组织中的浸润以及肺水肿的程度；ICI 182780干预废除非那雄胺的有益作用。结果表明抑制5α-还原酶活性、促进睾酮转化为E2，有利于创伤后改善Kupffer细胞功能，从而改善机体的免疫功能。此外，将失血性休克雄性大鼠Kupffer细胞分离并接受LPS刺激后，E2、PPT、DPT均在不同程度上降低了Kupffer细胞生成细胞因子诱导中性粒细胞趋化分子-1的能力，说明雌激素的作用是通过ER介导的[30]。

鉴于MAPKs在失血性休克发展进程中的关键作用，Suzuki等[31]关注了E2调节Kupffer细胞功能与MAPKs的关系。研究发现，ER-α激动剂PPT产生了与E2同样的治疗效果，即降低了Kupffer细胞产生IL-6、TNF-α、IL-10的水平，同时抑制了p38 MAPK、ERK1/2、JNK活化，ER-β激动剂DPN虽然可以减少这些细胞因子的产生，但细胞因子水平仍显著高于假手术组，且DPN并不能阻止MAPKs激活。此外，E2-BSA也发挥了与E2治疗相同的作用，该作用被ICI 182780消除[32]。结果提示，E2改善失血性休克后Kupffer细胞功能的有益作用主要是通过ER-α介导的MAPKs活化抑制实现的，而且这种作用部分通过非基因组途径介导。

在观察E2与Kupffer细胞TLR4关系的研究中发现，液体复苏时给予E2治疗能阻止失血性休克后C3H/HeN雄性小鼠Kupffer细胞TLR4蛋白表达、诱导型一氧化氮合酶、细胞因子水平的升高，使ATP含量、线粒体转录因子A基因表达、线粒体细胞色素c氧化酶Ⅰ(mitochondrial cytochrome c oxidase subunitⅠ，mtCOⅠ)的基因与蛋白水平恢复正常，而C3H/HeJ(TLR4突变体)小鼠未观察到ATP水平和mtCOⅠ蛋白表达的异常[33]。进一步研究显示，E2治疗在减少Kupffer细胞TLR4表达的同时，抑制了p38 MAPK和NF-κB的磷酸化，而C3H/HeJ小鼠没有出现Kupffer细胞p38 MAPK和NF-κB活化[34]。结果表明，TLR4依赖的ATP产生下调以及TLR4依赖的p38 MAPK和NF-κB活化，在失血性休克后E2介导的Kupffer细胞免疫保护中起关键作用。

Suzuki等[35]研究发现，E2治疗降低了失血性休克雄性小鼠Kupffer细胞产生IL-6、TNF-α的能力以及血浆IL-6、TNF-α水平，降低了Kupffer细胞NF-κB和AP-1 DNA结合活性以及IL-6、TNF-α mRNA表达。失血性休克也引起了Kupffer细胞过氧化物酶体增殖物激活受体γ(Peroxisome proliferator-activated receptor γ，PPARγ)的活性下降，E2治疗使PPARγ活性升高至正常水平，PPARγ拮抗剂GW9662消除了E2的有益作用，说明PPARγ激活在E2调节失血性休克后Kupffer细胞功能的有益作用中发挥重要作用，其机制可能是通过NF-κB和AP-1介导的。此外，E2增加了失血性休克雄性小鼠Kupffer细胞的Fc受体表达和蛋白激酶B(Protein kinase B，Akt)活化，恢复了Kupffer细胞吞噬作用，ICI 182780或3-磷酸肌醇激酶(Phosphoinositide 3-kinase，PI3K)/Akt抑制剂渥曼青霉素均废除了E2的治疗作用[36]，说明PI3K/Akt活化参与了失血性休克后E2介导的Kupffer细胞保护作用。

上述研究表明，雌激素维持了失血性休克后的Kupffer细胞的正常功能，其作用与ER-α相关的MAPKs下调、TLR4依赖的ATP产生下调以及p38 MAPK、NF-κB信号分子活化、PPARγ激活、PI3K/Akt活化有关。

5 雌激素调节失血性休克巨噬细胞的作用与机制

Mφ是机体重要的免疫细胞，具有抗感染、提呈抗原、启动免疫应答和免疫调节等重要作用，亦是失血性休克后最常受累的免疫细胞之一[5]。

研究发现，失血性休克降低了雄性C3H/HeN小鼠脾Mφ和腹膜Mφ的IL-1和IL-6水平，E2治疗使之恢复至正常水平，降低了IL-10含量[7]；去卵巢雌性CBA/J小鼠失血性休克后，腹膜Mφ的IL-1β和IL-6释放以及脾Mφ的IL-6和IL-12释放也显著降低，复苏过程给予皮下注射E2治疗，恢复了这些细胞因子的释放[8]。来自DHT预处理14 d的失血性休克去势雄鼠的脾和腹膜巨噬细胞体外释放IL-1β、IL-6显著减少、IL-10增加，E2或E2+DHT预处理的脾和腹膜巨噬细胞释放IL-1β、IL-6的能力无明显变化、IL-10降低[37]，这些结果初步明确了雌激素与Mφ功能的关系。

Knöferl等[28]进一步将8周龄雌性小鼠行卵巢切除术，2周后建立创伤失血性休克模型，创伤失血2 h后，分离脾和腹膜Mφ，发现去卵巢雌鼠Mφ释放IL-1、IL-6水平下降了约50%，而发情前期小鼠Mφ可以维持IL-1、IL-6释放；创伤出血后24 h通过盲肠结扎穿孔诱发败血症，去卵巢小鼠的死亡率显著高于发情前期小鼠。同样地，在失血性休克-败血症这一模型上，DHT预处理21 d去势雄性小鼠的脾Mφ产生TNF-α、IL-6的作用受到抑制，E2、DHT联合E2预处理则消除了这一现象[38]。研究结果表明，高水平雌激素有利于维护失血性休克后Mφ功能，降低败血症易感性和致死率。

为了进一步明确雌激素保护失血性休克Mφ的作用机制是否与ER有关，Hildebrand等[10，11]研究显示，E2治疗在恢复失血性休克脾Mφ体外产生TNF-α、IL-6能力、发挥细胞保护作用的同时，E2联合氟他胺治疗也恢复了脾Mφ产生TNF-α的能力。创伤出血显著降低了WT和ER-β-/-小鼠脾Mφ释放TNF-α、IL-6和IL-10的水平，E2或PPT治疗恢复了脾Mφ产生这些细胞因子的能力，但均未恢复到正常水平。Suzuki等[39]发现，E2与PPT治疗分别降低了失血性休克雄性大鼠血浆IL-6和IL-10水平的同时，抑制了脾Mφ、肺泡Mφ产生IL-10、增加IL-6、TNF-α的产生，DPN对肺泡Mφ产生了与E2相同的作用。研究结果表明ER在E2介导失血性休克后Mφ功能保护作用过程中有一定作用。

研究显示，失血性休克后2 h，雄性小鼠、DHT治疗去势雄性小鼠的脾Mφ和腹膜Mφ经LPS刺激15 min后，p38 MAPK的磷酸化水平显著增加，发情前期雌性小鼠、去势雄性小鼠以及E2治疗去势雄性小鼠的脾Mφ和腹膜Mφ的p38 MAPK的磷酸化水平显著降低[40]。Suzuki等[41]在失血性休克24 h后，分离了雄性大鼠的脾Mφ，经LPS再次处理30 min后，p38 MAPK、ERK1/2、JNK的磷酸化水平显著降低，经LPS处理1 h后NF-κB的DNA结合活性显著增加，经E2、PPT治疗后，雄性大鼠脾Mφ的p38 MAPK、ERK1/2、JNK磷酸化水平增加，NF-κB的DNA结合活性降低；DPN治疗也部分增加了脾Mφ的p38 MAPK、ERK1/2、JNK磷酸化水平，但对NF-κB的DNA结合活性无影响。来自失血性休克2 h后雄性大鼠的脾Mφ，经LPS再次处理30 min后，出现了与Suzuki等[41]研究一致的结果，E2-BSA治疗发挥与E2相似的作用，即提高了p38 MAPK、ERK1/2、JNK的磷酸化水平，而ICI 182780消除E2-BSA的作用。脾Mφ经LPS处理24 h后，p38 MAPK抑制剂SB203580降低了TNF-α、ERK1/2抑制剂PD98059降低了IL-6、JNK抑制剂SP600125降低了TNF-α和IL-6的水平[32]。

上述研究表明，雌激素可恢复失血性休克后Mφ功能，从而维持机体正常的免疫功能，其作用主要是通过ER相关的MAPKs特异性激活或抑制发挥作用，并且部分效果是通过非基因组途径进行的。

6 小结与展望

综上所述，雌激素对失血性休克后免疫功能具有良好的调节作用，从而使机体的炎症反应维持在可控范围内，减少脓毒症的发生。这一作用是通过不同ER调节脾细胞、T淋巴细胞、DCs、Kupffer细胞、Mφ等免疫细胞的功能正常化实现的，其机制与MAPKs、TLR4、NF-κB、AP-1信号分子以及NF-κB、AP-1介导的PPARγ激活有关，且部分作用是通过非基因作用进行的(图1)。这些研究在丰富雌激素药理学作用的同时，以免疫功能调控为切入点，为防治失血性休克提供了实验资料。但是，雌激素对影响失血性休克转归各环节的研究还较少，近五年对失血性休克免疫功能调节机制的研究几乎空白。由于免疫功能紊乱是失血性休克发展为脓毒症休克的关键环节，因此，应加强雌激素调节失血性休克后免疫功能的研究，可能为失血性休克的防治提供新的治疗策略。临床数据也显示，女性在创伤、失血性休克后器官衰竭的发生率低，败血症的发生也少，特别是在生育年龄的女性[42]。但是，临床科研方面的相关支撑资料还较少。今后，应全方位、多靶点地研究雌激素防治失血性休克的作用机制，加强临床研究，以期将雌激素抗休克作用的基础研究成果转化应用于临床。

图1 雌激素对失血性休克后脾细胞、T淋巴细胞、树突状细胞、Kupffer细胞和巨噬细胞的保护作用Fig.1 Protective effects of estrogen on splenocytes，T lymphocytes，dendritic cells，Kupffer cells and macrophages and their consequences following hemorrhagic shock.