菜豆愈伤组织的诱导效果及其凝集素水平分析

陈 高，刘 彤，万何平，陈禅友

（江汉大学 生命科学学院；湖北省豆类（蔬菜）植物工程技术研究中心，湖北 武汉 430056）

菜豆（Phaseolus vulgarisL.）为豆科菜豆属菜豆种的植物，又名四季豆、芸豆［1］。菜豆于16 世纪末开始在我国引种栽培，在中国的栽培历史已超过500年，现在在我国各地均有种植［2］，已成为我国主要的蔬菜及粮食作物。菜豆具有丰富的营养价值［3］，鲜荚含丰富的蛋白质、膳食纤维和糖类，其籽粒钙含量是黄豆的2 倍多，鸡的7 倍多。

菜豆中含有一种可以使血液凝集的蛋白质，称为菜豆凝集素，菜豆凝集素不仅是导致菜豆食用中毒的主要成分之一，同时也是菜豆抵御病虫害的主要手段之一［4-5］。因为菜豆凝集素对病虫害有一定的抵御及杀伤作用，其有作为一种生物农药的潜质，同时与一般农药不同，只需将其煮沸处理即可使其失活。如果将菜豆凝集素作为生物农药生产，一种可以快速高效生产菜豆凝集素的手段是必不可少的。组织培养技术作为一种生产植物次生代谢产物的有效手段［6-7］，可以有效解决菜豆生长周期长、菜豆产量受季节影响等问题，可以在短期内大量而持续地生产菜豆愈伤组织，为提取菜豆凝集素提供原材料。

本研究以‘Bean Saint esprit a oeil rouge’‘Bean White rice’‘97-5 架豆’为材料，选取其组培苗的茎、叶、子叶作为外植体，进行愈伤组织培养，并选取长势较好的愈伤组织进行凝集素水平测定，为进一步快速高效地生产菜豆凝集素，研制植物源生物农药提供数据支持及试验基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本试验所用的 3 个菜豆品种为‘Bean Saint esprit a oeil rouge’‘Bean White rice’‘97-5 架豆’，均由江汉大学生命科学学院和湖北省豆类（蔬菜）植物工程技术研究中心提供。

1.2 试验方法

1.2.1 无菌苗的获得 菜豆的消毒灭菌参考文献［8］的方法，略有改动。选择表面无皱纹、光滑、无损伤且籽粒饱满的‘Bean Saint esprit a oeil rouge’‘Bean White rice’‘97-5 架豆’菜豆种子各 40 粒分别放入培养瓶中，用自来水洗涤30 s，转移至无菌工作台操作。用70%酒精振荡30 s，倒入无菌水洗净菜豆表面的酒精，加入升汞振荡8 min，加入无菌水反复振荡洗涤5 ～6 次，每次1 ～2 min，加入无菌水浸泡菜豆4 ～6 h，直至菜豆膨胀，表面没有褶皱。将菜豆接种入MS 培养基［9］，封口放入培养室培养6 ～7 d，培养温度25 ℃，光照12 h/d。

1.2.2 菜豆外植体（茎、叶、子叶）接种及植物组织培养 在超净工作台上将菜豆组培苗的不同外植体（茎、叶、子叶）切成0.5 ～1 cm 的小段，分别转入6 种不同激素配比（见表1）的MS 培养基中，每种菜豆的不同外植体做3 个平行对照组。放入培养室中以培养温度25 ℃、光照12 h/d 进行培养，每隔7 d 观察并记录各培养基中各外植体的愈伤组织生成情况。

表1 不同激素配比Tab.1 Hormone formular /（mg·L-1）

1.2.3 菜豆凝集素的含量测定 将生长良好的不同菜豆外植体的愈伤组织取出，称取5 g，分别在研磨时加入0.2 mol/L pH=7.2 的磷酸盐缓冲液（PBS）15 mL 磨成（可加入石英砂帮助研磨）水溶液状，在4 ℃下8 000 r/min 离心20 min，取上清液，4 ℃保存。

检测凝集素含量使用血凝法［10］，略有改动。用采血管从兔耳中静脉血管采血，将兔血与Alsever′s液按1∶4 的比例混合，装入离心管放入冰箱中4 ℃保存。取96 孔V 型凝血板，在每一孔中加入25 μL 0.2 mol/L pH=7.2 的PBS，第一列除外，再在第一、二列加入各品种菜豆的3 种外植体的凝集素溶液25 μL，每种菜豆的各外植体凝集素做3 组对照（一共27 列）。将每行第二列孔内溶液混匀，取出25 μL加入每行第三孔，再混匀，取出25 μL 溶液加入第四孔，以此类推，做倍比稀释，直到最后一孔，取出25 μ L 溶液弃掉。观察凝集素水平前，先将装有兔血的离心管放入冷冻离心机中，在4 ℃下1 000 r/min 离心5 min，弃上清液，以 1∶3 的比例加入 PBS 缓冲液，反复数次至上清液澄清。取10 μL 兔血溶液加入PBS 缓冲液稀释至1 mL，在显微镜下用细胞计数法观察细胞数量，以平均2 × 108个/mL 细胞的标准稀释兔血溶液。再在V 型凝血板中每格样品溶液中各加入25 μL 稀释好的兔血溶液，将凝血板25 ℃下静置2 h，放在灯光下观察凝血结果，并拍照记录，凝集现象如图1 所示，计算凝集活力［11］。凝集活力的计算公式为：凝集活力（HU）=2n/50，其中n为样品在凝血板中半凝集时，倍比稀释的孔数。

图1 红细胞凝集示意图Fig.1 Schematic diagram of red blood cell aggregation

2 结果与分析

2.1 不同激素对子叶愈伤组织诱导的影响

由表2 可知，在培养1 周后，不同浓度的2，4-D 和KT 含量比例的培养基诱导菜豆子叶愈伤组织生成的差异十分明显。在加入相同浓度的6-BA 的条件下，保持培养基中KT 浓度相同，增加2，4-D 浓度，可观察到‘97-5 架豆’‘Bean White rice’‘Bean Saint esprit a oeil rouge’子叶的愈伤率均明显上升，而保持培养基2，4-D 浓度相同，增加KT 的浓度，可观察到3 种菜豆子叶的愈伤率均增长不明显，所以分析后可知2，4-D 诱导子叶愈伤组织生成的效果优于KT。培养2 周后，观察菜豆子叶愈伤组织的生长情况，可得出使用DBKC2培养基，即使用MS + 3 mg/L 2，4-D + 0.5 mg/L 6-BA + 0.5 mg/L KT 激素配比的培养基能使‘97-5 架豆’‘Bean White rice’‘Bean Saint esprit a oeil rouge’子叶的愈伤率达到最大。观察‘97-5 架豆’‘Bean White rice’‘Bean Saint esprit a oeil rouge’的子叶培养基中的子叶外植体，可发现DBKA1培养基中子叶基本褐化，并基本不生成愈伤组织，随着培养基中2，4-D、KT 含量增加，可观察到除了愈伤率增大、有淡黄色的愈伤组织产生以外，子叶的褐化率也随之降低，可推测若需降低子叶外植体褐化率需加入足够的 2，4-D 和 KT。因此，可得到‘97-5 架豆’‘Bean White rice’‘Bean Saint esprit a oeil rouge’的适宜子叶愈伤组织诱导的培养基是DBKC2，即MS+3 mg/L 2，4-D+0.5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L KT。

2.2 不同激素对茎愈伤组织诱导的影响

由表3 可知，培养1 周后，不同浓度的2，4-D 和KT 含量的培养基在诱导菜豆茎愈伤组织生成的差异不明显。在加入相同浓度的6-BA 的条件不变的情况下，保持培养基内KT 浓度相同，增加2，4-D 浓度，可观察到‘97-5 架豆’‘Bean White rice’茎愈伤组织的愈伤率有所上升，‘Bean Saint esprit a oeil rouge’愈伤率变化不明显。保持培养基2，4-D 浓度相同，增加KT 的浓度，可观察到‘97-5 架豆’‘Bean White rice’‘Bean Saint esprit a oeil rouge’茎的愈伤率基本无变化。虽然2，4-D、KT 对茎愈伤组织愈伤率影响不大，但激素含量高的培养基所生成的愈伤组织体积更大，结构更加紧密。培养2 周后，可观察到‘97-5 架豆’‘Bean White rice’‘Bean Saint esprit a oeil rouge’茎的愈伤率基本都达到100%，得到比较紧凑且体积较大的乳白色或淡黄色的愈伤组织，且基本没有出现褐化。可推测出含有不同激素的培养基对茎愈伤组织诱导效果的影响很小，但2，4-D、KT 含量高能使茎长出更多、更紧密的愈伤组织。因此，可得知‘97-5 架豆’‘Bean White rice’‘Bean Saint esprit a oeil rouge’的适宜茎愈伤组织诱导的培养基是DBKC2，即MS + 3 mg/L 2，4-D + 0.5 mg/L 6-BA+ 0.5 mg/L KT。

表2 不同激素对子叶愈伤组织诱导的影响Tab.2 Effect of different hormones on callus induction of cotyledons /%

表3 不同激素对茎愈伤组织诱导的影响Tab.3 Effect of different hormones on callus induction of stem /%

2.3 不同激素对叶愈伤组织诱导的影响

由表 4 可知，培养 1 周后，不同浓度的 2，4-D 和 KT 含量的培养基在诱导‘97-5 架豆’‘Bean White rice’叶愈伤组织生成的差异不明显，但在加入相同浓度的6-BA 的条件下，保持培养基中KT 浓度相同，增加2，4-D 浓度，可观察到‘Bean Saint esprit a oeil rouge’叶的愈伤率明显上升，而保持培养基2，4-D浓度相同，增加KT 的浓度，可观察到‘Bean Saint esprit a oeil rouge’叶的愈伤率降低，可推断2，4-D 对‘Bean Saint esprit a oeil rouge’叶诱导愈伤有促进作用，而在2，4-D 含量高的情况下，KT 对‘Bean Saint esprit a oeil rouge’叶诱导愈伤则有抑制作用。培养2 周后，可观察到‘Bean Saint esprit a oeil rouge’叶的愈伤率基本达到100%，‘97-5 架豆’‘Bean White rice’的DBKC2培养基中叶的愈伤率基本能达到80%。可观察到3 种菜豆叶的愈伤组织呈米黄色或绿色，均未出现褐化现象。‘97-5 架豆’‘Bean White rice’‘Bean Saint esprit a oeil rouge’的适宜叶愈伤组织诱导的培养基是DBKC2，即MS + 3 mg/L 2，4-D +0.5 mg/L 6-BA + 0.5 mg/L KT。

表4 不同激素对叶愈伤组织诱导的影响Tab.4 Effect of different hormones on callus induction of leaf /%

2.4 不同外植体对菜豆愈伤组织诱导的影响

由表2、表3、表4 可知，培养 2 周后，观察‘97-5 架豆’‘Bean White rice’‘Bean Saint esprit a oeil rouge’的子叶、茎、叶愈伤组织生长状况，可看出在培养条件相同的情况下，3 种菜豆均为茎愈伤率最高，几乎都是100%，愈伤组织基本呈绿色或米黄色，少数为乳白色，愈伤组织的结构饱满，且基本不会出现褐化现象。3 个菜豆品种叶的愈伤率较高，愈伤组织呈淡黄色，且基本无褐化现象，但其愈伤组织体积小且结构疏松，其基本只在叶与培养基的接触面生长。子叶的愈伤率最低，长出的愈伤组织体积小且疏松，呈绿色或白色，少数呈淡黄色，且子叶褐化率较高，褐化与培养基激素的含量有一定的关系，褐化比较严重的子叶基本不能诱导出愈伤组织。

2.5 菜豆凝集素水平测定结果

由表5 可得知，在3 个菜豆品种中，‘Bean Saint esprit a oeil rouge’各个外植体的愈伤组织的凝集活力均最高。而在‘Bean Saint esprit a oeil rouge’3 种外植体中，子叶和叶愈伤组织的凝集活力最高；再结合表2、表3、表4 观察，虽然总的来说茎的愈伤组织生长状态最好，但是单就适宜激素组合DBKC2来看，‘Bean Saint esprit a oeil rouge’的3 种外植体第14 天愈伤率均为100%，未见明显差异；综合凝集素含量考虑，选取‘Bean Saint esprit a oeil rouge’的子叶和叶在MS+3 mg/L 2，4-D+0.5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L KT 中进行植物组织培养可提取较多的菜豆凝集素。

表5 菜豆凝集素水平测定结果Tab.5 Results of determination of common bean lectin level

3 讨论

在愈伤组织培养过程中，添加不同的激素对愈伤组织的诱导效果不同，常见的激素配比多为一种生长素加上一种细胞分裂素，而本试验中激素配比为一种生长素加上两种细胞分裂素。在前期试验中，2，4-D + 6-BA 的激素组合培养出来的菜豆愈伤组织过于紧密，而2，4-D + KT 的激素组合培养出来的菜豆愈伤组织的含水量又太高，因而在本试验中将两种细胞分裂素组合起来，得到了结构较为松散且含水量较少的愈伤组织，且部分组合的愈伤率达到了100%。

在菜豆组织培养中基因型是影响菜豆愈伤诱导效果的重要因素之一。在朱有光等［12］的菜豆的组织培养和植株再生研究中，不同菜豆的愈伤率也不相同，可见不同基因型的菜豆的愈伤诱导效果有差异。本试验中，在‘97-5 架豆’‘Bean White rice’‘Bean Saint esprit a oeil rouge’3 种菜豆中，‘Bean Saint esprit a oeil rouge’的愈伤率最高，且愈伤组织的体积最大，愈伤生长状态最佳，‘97-5 架豆’次之，‘Bean White rice’最差。同时‘Bean Saint esprit a oeil rouge’愈伤组织中的凝集素含量也最高，与前期试验‘Bean Saint esprit a oeil rouge’菜豆豆荚的凝集素含量最高保持一致［13］。但同时，菜豆愈伤组织中的凝集素含量低于菜豆豆荚中的凝集素含量，这可能是由于愈伤组织的生长环境较为良好，无外来威胁刺激其表达菜豆凝集素。为提高菜豆愈伤组织的凝集素含量，可在后期研究中向培养基中添加一些菜豆凝集素的前体物质，或者一些相关病虫害的粉末，刺激菜豆愈伤组织合成更多的菜豆凝集素。

不同外植体的选择不仅影响菜豆愈伤组织的形成，也对其愈伤组织的凝集素含量有重要影响。包英华等［14］在豇豆再生体系建立的研究中发现，各外植体在相同培养条件下茎尖的愈伤诱导效果最好，叶次之，与本研究结果相似。同时，有研究表明［15］菜豆凝集素主要分布在籽粒中，而本研究发现子叶与叶的愈伤组织凝集素含量较高，可见选取凝集素含量较高的外植体进行组织培养获得的愈伤组织凝集素含量也较高。

综上所述，3 个菜豆品种的3 种外植体在MS + 3 mg/L 2，4-D + 0.5 mg/L 6-BA + 0.5 mg/L KT 的培养基中培养获得的愈伤组织愈伤率最高且长势较好。同时，用‘Bean Saint esprit a oeil rouge’的子叶与叶作为外植体产生的愈伤组织凝集素含量最高。因此，使用‘Bean Saint esprit a oeil rouge’的子叶或叶为外植体，在MS + 3 mg/L 2，4-D + 0.5 mg/L 6-BA + 0.5 mg/L KT 中进行培养可获得较多的菜豆凝集素。本试验为进一步研究菜豆凝集素生物农药提供了试验基础与数据支持。