新生儿ABO溶血病微柱凝集法放散试验中放散液剂量优化研究*

屈柯暄，周丽华，王淑霞，吕孟兴

(1.昆明市儿童医院输血科，昆明 650228；2.昆明市妇幼保健院检验科，昆明 650031)

新生儿溶血病(hemolytic disease of the newborns，HDN)主要是指母婴血型不合引起的新生儿同种免疫性溶血性疾病，在我国以母婴ABO血型不合导致的ABO溶血病(ABO-HDN)最多见。该病的诊断主要依靠血型血清学检查，放散试验阳性是确诊新生儿溶血病最重要的依据[1-2]。由于新生儿血液的特点(血型抗原表达数量少及发育不完全，血浆抗体效价低等)，在日常工作中放散试验往往出现较弱的阳性结果，与患儿临床症状不相符；部分患者临床症状符合新生儿溶血病，或按照新生儿溶血病治疗效果好，放散试验结果却为阴性，给临床早期诊治带来极大困扰。为提高放散试验的阳性检出率，为临床早诊断早治疗提供实验室依据，降低ABO-HDN对新生儿造成的损害，我们采用目前敏感度高、特异度强的微柱凝集法 (microcolumn gel test，MGT) 对临床诊断为ABO-HDN的新生儿血液标本进行检测，根据微柱凝集卡反应腔容量，每个血标本同时选择三种不同剂量的放散液进行平行试验，现将结果报道如下：

1材料与方法

1.1 研究对象 2018年1～9月，以黄疸或高胆红素血症收入三级甲等儿童医院的新生儿患者869例，排除母亲和新生儿血型相同的病例257例；排除不规则抗体引起的新生儿HDN患者5例；排除其它原因(感染、窒息、母乳性黄疸等)引起的高胆红素血症的患儿166例，最终选取母婴ABO血型不合、出生后24 h内出现黄疸或高胆红素血症并迅速发展，按照ABO-HDN治疗效果好的新生儿441例，采集患儿EDTA抗凝血标本3 ml备用。新生儿高胆红素血症诊断参考文献[3]；HDN诊断标准参考文献[4]。

1.2 试剂和仪器

1.2.1 试剂耗材：ABO血型反定型试剂盒(人血红细胞)、不规则抗体检测试剂(人血红细胞)、低离子强度盐溶液、ABO，RhD血型定型检测卡(单克隆抗体)、ABO，RhD血型检测卡(微柱凝集)、抗人球蛋白检测卡(不规则抗体筛检)，以上试剂均由长春博迅生物技术有限责任公司提供；昆明南疆制药0.9 g/dl氯化钠注射液；泰州科健医疗用品有限公司12*100mm玻璃试管；泰州为尔康医疗用品有限公司2 ml一次性塑料吸管。

1.2.2 仪器设备：长春博研科学仪器有限公司TD-3A型血型血清学用离心机、FYQ型免疫微柱孵育器；安徽中科中佳科学仪器有限公司LC-10C低速离心机；日本Kubota公司KA-2200血型血清学专用离心机；上海跃进医疗器械有限公司HH-W21-600S型电热恒温水浴箱；Eppendorf移液器。

1.3 方法 纳入研究的441例新生儿血液标本，均采用微柱凝集法进行放散试验，试验操作参照《输血技术操作规程(输血科部分)》[5]及试剂盒说明书。根据微柱凝胶卡反应腔容量(约200 μl)，每个血标本均同时选择低(25 μl)，中(50 μl)，高(100 μl)三种剂量的放散液进行平行试验，操作步骤：①取微柱凝胶抗人球蛋白检测卡一张 ，做好25，50，100 μl标记。用低离子强度盐溶液将ABO血型反定型试剂盒(人血红细胞)配成0.8 ml/dl～1 ml/dl浓度，分别加入微管中，各50 μl。②按标记剂量逐一加入制备好的放散液，最后一管加入末次洗涤液50 μl。③置37℃免疫微柱孵育器，孵育15 min。TD-A型血型血清学专用离心机离心5 min，取出，观察结果。④凝集强度判定同检测卡操作说明书结果解释部分，见图1。⑤放散试验结果判读[6]参照表1。

表1 放散试验结果判读

注：“+”代表阳性，包括凝集强度为±，1+，2+，3+，4+的凝集；“-”代表阴性。

图1 凝集结果判定与ABO血型反定型

将试验结果按照三种剂量分为25 μl组，50 μl组和100 μl组。计算三组实验结果的阳性百分率。

1.4 统计学分析 采用SPSS17.0软件对数据进行处理，收集的三种剂量试验结果属于计数资料，用百分率表示，组间比较采用χ2检验，当P<0.05表示阳性检出率差异有统计学意义，当P<0.001表示阳性检出率差异有统计学显著性意义，比较三种剂量放散液阳性检出率，得到最佳放散液剂量。

2结果

2.1 2018年1～9月纳入研究的新生儿基本情况统计 见表2。

表2 研究对象基本情况

2.2 不同剂量放散液阳性检出率的比较 见表3。在临床诊断为ABO-HDN的441例新生儿血液标本中，三种剂量放散液阳性检出率为82.09%，82.77%和99.55%。25 μl和50 μl两组阳性检出率比较差异无统计学意义(P>0.05)；25 μl和100 μl两组阳性检出率比较差异有统计学显著性意义(P<0.001)；50 μl和100 μl两组阳性检出率比较差异有统计学显著性意义(P<0.001)。

表3 不同剂量放散液阳性检出率比较

注：a代表25 μl组和50 μl组比较；b代表50 μl组和100 μl组比较；c代表25 μl组和100 μl组比较。

3讨论ABO-HDN是儿科最常见的急性溶血性疾病，引起的高胆红素血症一般在出生后24 h内出现并迅速发展，引起胆红素脑病或继发性核黄疸，对新生儿造成永久性神经系统发育损伤，由此可见ABO-HDN引起的潜在危险性不容忽视[1，7-8]。但是由于新生儿血液特点(血型抗原表达数量少及发育不完全，血浆抗体效价低等)，同时溶血性抗体随疾病进展而逐渐消耗等原因，可能造成确诊疾病的放散试验出现假阴性结果，给临床早期诊断带来困扰。

本研究收集三级甲等儿童医院近10个月的黄疸或高胆红素血症新生儿病例资料869例，通过排除法，最终得到符合研究条件的新生儿441例。在统计病例资料时，我们发现有64.6%的新生儿在1～6天的日龄范围内出现明显的黄疸或高胆红素血症等临床症状；有75.7%的新生儿静脉血胆红素值在201～400 μmol/L的较高水平，说明ABO-HDN疾病进展快，胆红素水平高，容易引起胆红素脑病或继发性核黄疸，严重危害新生儿健康。因此，对ABO-HDN放散试验进行优化研究有重要临床意义。

有文献报道，增加放散液的剂量，可以提高放散试验的阳性检出率，放散液增加到75 μl时，阳性检出率提高到73.19%[9]。国内外文献报道微柱凝集法进行新生儿溶血病血清学检测试验，敏感度高，特异度强，有助于提高新生儿溶血病的阳性检出率[10-12]。为了提高ABO-HDN放散试验的阳性检出率，我们选择美国血库协会[13]、英国血液标准化委员会推荐的，有助于提高新生儿溶血病阳性检出率的微柱凝胶抗入球蛋白法(MGT)方法进行放散试验的优化研究。根据微柱凝集卡反应腔的容量(约200 μl)，设计低、中、高三种剂量放散液进行平行试验，结果显示：在临床诊断为ABO-HDN的441例患儿中，25 μl放散液组有79例结果表现为假阴性、未被检出；50 μl放散液组有76例结果表现为假阴性、未被检出；而100 μl放散液组只有2例结果表现为假阴性、未被检出。将3个剂量组阳性检出率进行统计分析，我们发现100 μl组阳性检出率明显高于其它剂量组，检验效果最佳。其次，在研究中我们发现增大放散液剂量能有效增强凝集强度。当25 μl和50 μl放散液组试验结果阳性时，凝集强度较弱，多为±，1+，2+；使用100 μl剂量放散液时，凝集强度较强，多为3+至4+。100 μl组放散液检测结果为较弱的1+或±时，25 μl和50 μl组检测结果就会出现假阴性等漏检的情况。我们分析多是因为新生儿血型抗原表达数量少及发育不完全，其结合的IgG类血型抗体少，经过热放散后放散液中IgG抗体效价低导致。

综上所述，在ABO-HDN微柱凝集法放散试验中，选取100 μl剂量放散液，试验效果好、阳性检出率高、凝集强度大，能有效提升放散试验临床诊断价值，为早期ABO-HDN诊断提供有力的实验室依据，减轻溶血病对新生儿造成的严重危害。同时，为新生儿溶血病血清学检测标准操作程序的制定提供参考依据。