骨骼肌钝挫伤后线粒体自噬相关基因及自噬体变化研究

董贵俊 温含 张英祥 田雪文 李可峰 葛新发

1 山东体育学院（济南250102）

2 天津体育学院（天津300381）

骨骼肌钝挫伤是常见的运动损伤，特别是股四头肌和腓肠肌的钝挫伤最为常见[1]。钝挫伤后受损组织由于细胞损坏、血管破损、炎细胞浸润、缺血后再灌注等因素导致局部组织供氧不足[2，3]，有氧代谢能力显著下降从而诱发能量供给障碍[4]，不利于受损部位通过自身循环代谢完成自身免疫、肌纤维再生与重组，从而严重影响损伤后的恢复速度[5，6]。低氧诱导因子-1（hy⁃poxia-inducible factor-1，HIF-1）是细胞中缺氧应激调节的关键转录因子[7，8]。HIF-1 是异源二聚体蛋白，主要由HIF-1α和HIF-1β两个亚基组成，其中HIF-1α亚基受缺氧调控并调节HIF-1 的活性。在缺氧条件下，HIF-1 被激活后调节多种靶基因的转录，介导机体对缺氧应激反应的信号通路。腺苷酸活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）是具有α1 或α 2催化亚基的异三聚体，它是生物能量代谢调节的关键分子，当ATP浓度水平降低时，AMPK可被激活[9]。

机体能量供应不足或氧化应激状态下，产生大量活性氧簇（ reactive oxygen species，ROS），进而影响线粒体分裂-融合的平衡使得线粒体从形态上进行代偿[10，11]。而且，细胞内ROS水平的升高、线粒体分裂-融合的动态变化也会促进线粒体自噬的发生[12，13]，以清除功能障碍、受损的线粒体，达到保持细胞生理功能稳定、抑制活性氧的作用[14-16]。研究发现，高浓度的ROS也可直接激活HIF-1[7]。Bnip3 和Nix 是HIF-1 的靶基因，属于促凋亡蛋白，在缺氧条件下可以诱导细胞凋亡，还可诱导细胞自噬[17，18]。

骨骼肌钝挫伤后，受损组织缺血造成缺氧环境，有氧代谢能力显著下降进而造成能量供给障碍，产生氧化应激，诱发ROS 水平升高。缺氧或ROS 水平升高可能激活能量代谢和缺氧应激的关键因子表达，从而诱发钝挫伤后线粒体自噬相关基因表达及自噬体发生，进而促进线粒体更新以利于其质量控制，但目前关于钝挫伤后线粒体自噬发生情况及相关机制尚不明确。因此，本研究通过建立中等程度腓肠肌钝挫伤模型，研究钝挫伤后能量代谢关键因子及自噬相关蛋白，包括AMPKα2、HIF-1α、BNIP3 和NIX 的表达情况，探讨腓肠肌钝挫伤后自噬发生的可能诱发机制，对于揭示钝挫伤后线粒体损伤重建机制具有重要理论意义。

1 研究对象与方法

1.1 研究对象

Wistar 雄性大鼠64 只，体重210～230 g。大鼠及大鼠常规饲料由山大动物饲养中心提供。在山东体育学院动物房饲养大鼠。动物饲养房光照周期被控制为12 h/12 h 明暗循环（早08：00 亮灯，晚20：00 关灯），大鼠被饲养在标准笼内，采取一笼一鼠的饲养方式。标准条件下，自由进食、饮水，每周更换3次垫料，保持通风，室温（21 ± 1）℃，实验动物使用获得相关的动物管理及使用委员会的批准。

随机分为8 组（n=8）。一组为对照组，另7 组为钝挫伤组。钝挫伤组按照伤后取材时间又分为12 h组、2 d组、5 d组、7 d组、10 d组、15 d组、30 d组。参考董贵俊[5]等钝挫伤方法造模：将实验大鼠腹腔10g/L 硫喷妥钠注射麻醉后，固体木制圆柱体下落导致右小腿内侧面（其皮下为腓肠肌中段）一次打击伤。打击半径0.5 cm，打击体长度1.16 m，质量0.62 kg，打击高度0.40 m，打击重力为6108 N，打击动能为2143 J。解剖学指标、CK 等生理指标综合分析鉴定为中度损伤[13]。造模后按时间顺序取腓肠肌，部分置入－80℃冰箱保存用于电镜制片和qRT-PCR，部分直接提取蛋白进行蛋白质免疫印迹（Western blotting）检测。

1.2 研究方法

1.2.1 透射电镜观察受损部位自噬体形成

腓肠肌取材后经生理盐水漂洗，于2%多聚甲醛-2.5%戊二醛中4℃固定2 h，后经0.1M磷酸缓冲液漂洗15 min，重复3次，随后保存于缓冲液中，并于4℃冰箱保存过夜。第2天将保存过夜的材料于1%锇酸中固定1 h，后置于50%、70%、90%、100%乙醇中依次浸泡15 min；再用100%乙醇、丙酮（1：1）混合液中固定15 min；最后在100%丙酮中固定15 min。

将固定好的组织块在100%丙酮、包埋液（1∶1）混合液中室温浸透2 h进行包埋，37℃烘箱中12 h，之后于60℃放置24 h 进行聚合。用LEICA EM UC6 超薄切片机将组织块切成规格为60～70 nm 超薄切片，每只大鼠同一取材部位包埋块选取3张，于HITACHI H-7650 透射电镜下选择10 个相邻的非重叠视野观察骨骼肌超微结构并拍照。

1.2.2 RNA提取，反转录及qRT-PCR

1.2.2.1 总RNA提取

取液氮中冷冻的腓肠肌组织0.2 g，研碎后加入1 mL Trizol（Sigma，USA）充分研磨，转入EP 管中室温静置5 min。以5∶1（V/V）Trizol：氯仿的比例加入氯仿，漩涡震荡15 秒，室温静置3 min，4℃12000 r/min，离心15 min。取上层水相，按2∶1（V/V）Trizol：异丙醇的量加入异丙醇，室温放置10 min，4℃12000 r/min 离心10 min。弃上清，以1∶1 等比例加入75%乙醇进行洗涤，7500 r/min，4℃离心5 min，弃上清。将沉淀的RNA在室温下干燥6 min，后用20 μL RNase-free water 重悬RNA，－80℃保存备用。

1.2.2.2 反转录和qRT-PCR

总RNA 提取后，应用NanoPhotometer P330（Im⁃plen，Munich，Germany）对RNA 浓度和质量进行鉴定。取适量组织总RNA（不超过50 ng）采用试剂盒RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit（Fermen⁃tas，USA）进行反转。随后，采用SYBR green（Ap⁃plied Biosystems，CA，USA）做为荧光染料进行qRTPCR，程序设计如下：95 ℃30 s，1 循环；95 ℃，5 s，60 ℃ 30 s，40 循环（Applied Biosystems StepOne ™Fast Real-time PCR system）。实验中所使用的引物见表1。目的基因的RNA表达水平的相对定量分析采用2-ΔΔCt方法。

1.2.3 Western blotting检测

总蛋白提取：取适量组织置于玻璃匀浆器，加200 μL RIPA 裂解液，手动研碎并置于冰上30 min 后14000 转离心20 min，吸上清，提取组织总蛋白并使用Nanodrop超微量核酸蛋白测定仪进行蛋白定量。根据SDS-PAGE 上样量需要，取适量样品加入4×loading buffer后，100℃煮沸变性5 min。

SDS-PAGE 电泳：分离胶凝胶浓度为10%，浓缩胶浓度为4%。上样量为10 μL。浓缩胶恒压80V，约40 min；分离胶恒压120 V，电泳至溴酚蓝到凝胶底部。

转膜：采用湿法转膜设置，恒流300 mA，冰浴转膜2 h。

Western blotting：（1）封闭：将膜浸没在Western blotting 封闭液Ⅱ（TBST 溶解的5%脱脂奶粉，pH7.5）中室温轻摇90 min（封闭液须覆盖整张膜，且膜在其中能够摇动为宜）。（2）一抗孵育：用Western blotting封闭液Ⅱ按1：500 稀释一抗，室温孵育30 min，放4℃过夜。（3）洗膜：TBST 洗膜7 次，每次5 min。（4）二抗孵育：用Western blotting 封闭液Ⅱ稀释二抗，目的蛋白用羊抗鼠-HRP 1∶20000或羊抗兔-HRP 1：10000（根据一抗进行选择）室温孵育60 min。（5）洗膜：TBST 洗膜7 次，每次5 min。（6）ECL 反应、曝光扫描：一张8 cm×6 cm大小的膜用1 ml ECL（500 μl A 液+500 μl B 液）室温避光反应5 min，曝光1 min（曝光时间随不同光强度而调整）。（7）内参用羊抗鼠β-tabulin 1：500稀释，室温孵育30 min，放4℃过夜，洗膜7遍，每次5 min，再加羊抗鼠-HRP 1∶10000 二抗，室温孵育60 min，洗膜7次，每次5 min。

主要试剂及仪器如下：β-tubulin 兔抗单克隆抗体（Cat#：ab179513）、AMPKα2 兔抗多克隆抗体（Cat#：ab3760）、HIF-1α 兔抗单克隆抗体（Cat#：14179S）、BNIP3 兔抗单克隆抗体（Cat#：ab109362）、NIX 兔抗多克隆抗体（Cat#：ab83808）由abcam Co.Ltd提供；山羊抗兔IgG（H+L）HRP（Cat#：ZB2301）由ZSGB-BIO. Co.Ltd提供；总蛋白抽提试剂盒（Cat#：BSP003）购自Sangon⁃bio.Co.Ltd；高灵敏ECL 发光试剂盒（Cat#： WB⁃KLS0500）、PVDF 膜（Cat#：IPVH00010）购自Millipore公司；Western Show预染蛋白Marker（Cat#：26616）购自Thermo.Co.Ltd；Western blotting 封闭液Ⅱ（奶粉，pH7.5）（Cat#：PC0020）、TBS（pH8.0，20 ×）（Cat#：T1080）、SDS-PAGE 上样缓冲液（还原，4×）（Cat#：P1015）购自Solarbio.Co.Ltd。Mini-PROTEAN Tetra Electrophoresis System、BIO-RAD ChemiDoc XRS 凝胶成像系统、Powerpac Basic电泳仪由BIO-RAD（USA）提供；温控摇床由New Brunswich（USA）提供；Nanodrop超微量核酸蛋白测定仪由Thermo公司（USA）提供。

1.3 数据统计及处理

本研究中所有数据均用SPSS17.0软件进行统计学分析，选择单因素方差分析各组均值的组间差异。研究数据采用平均数±标准差± s）的形式表示。P＜0.05表示差异显著，P＜0.01表示差异极显著。

2 结果

2.1 钝挫伤后骨骼肌缺氧、自噬相关因子HIF-1α、AMPKα2、BNIP3、NIX蛋白表达

钝挫伤后，12 h、2 d组腓肠肌HIF-1α蛋白质的表达水平比对照组显著升高（P＜0.01）；随后表达水平逐渐下降，但5 d、7 d、10 d组的表达水平仍显著高于对照组（P＜0.05）；伤后15 d、30 d组，HIF-1α蛋白表达水平基本恢复至正常水平（P＞0.05）（图1）。

图1 不同组别HIF-1α表达柱状图（n=8）

钝挫伤后，与对照组相比，腓肠肌AMPKα2蛋白质12 h、2 d、5 d 组诱导表达升高（P＜0.05，P＜0.01）。7 d、10 d、15 d、30 d组与对照组相比无显著差异（图2）。

图2 不同组别AMPKα2表达柱状图（n=8）

腓肠肌钝挫伤后12 h、2 d、5 d、7 d、10 d 组的BNIP3 表达水平比对照组显著提高，特别是12 h 组和2 d 组BNIP3 表达表达水平是对照组的1.9 倍（P＜0.01），伤后5 d、7 d、10 d 组BNIP3 表达水平较12 h、2 d组时有所回落，但仍显著高于对照组（P＜0.05）（图3）。

图3 不同组别BNIP3表达柱状图（n=8）

NIX 灰度值比较发现，腓肠肌损伤发生后12 h、2 d 组的NIX 表达水平是对照组的4 倍（P＜0.01），5 d 组的表达水平是对照组的2.5 倍（P＜0.05），7 d 组的表达水平仍维持在对照组的1.6倍（P＜0.05），10 d组的表达水平与对照组无显著性差异（P＞0.05）（图4）。

图4 不同组别NIX表达柱状图（n=8）

图5 显示HIF-1α、AMPKα2、BNIP3 和NIX 四个蛋白表达特点是表达量趋势图呈现出四条开口向下的抛物线，峰值前斜率大，既短期内迅速升高至最高点；峰值后形成一个小平台期，后开始以相对较小斜率恢复，直至正常水平。

图5 不同组别各蛋白表达变化趋势图

2.2 钝挫伤后骨骼肌缺氧相关因子Hif-1α、Ampkα2、Bnip3、Nix mRNA表达变化

图6结果说明骨骼肌钝挫伤发生后，伤后2 d、5 d组与对照组相比Hif-1α mRNA 表达增高，其中2 d 组增高非常显著（P＜0.01），增高水平达到对照组4～5 倍左右；5 d组与对照组相比也有显著增高（P＜0.05）。其余损伤组中仅12 h 组高于对照组，但并无显著性差异，其他表达与对照组基本一致。

图6 不同组别Hif-1α mRNA表达柱状图

图7 结果表明骨骼肌钝挫伤发生后，伤后12 h、2 d、5 d组与对照组相比Ampkα2 mRNA表达增高，其中12 h、2 d 组增高非常显著（P＜0.01），增高水平近对照组3倍；5 d与对照组相比也有显著增高（P＜0.05）。

图7 不同组别Ampkα2 mRNA表达柱状图

图8结果表明损伤组除15 d、30 d外，其余时间与对照组相比Bnip3 mRNA 表达增高，其中12 h、2 d 组增高非常显著（P＜0.01），增高水平接近对照组3倍；5 d与对照组相比也有显著增高（P＜0.05），表达量也近似于对照组的2 倍，7 d、10 d 组表达也明显高于对照组（P＜0.05）。

图8 不同组别Bnip3 mRNA表达柱状图

图9 表明损伤组与对照组相比Nix mRNA 表达在12 h、2 d 组增高非常显著（P＜0.01），增高水平接近对照组3 倍；5 d 与对照组相比也有显著增高（P＜0.05），表达量为对照组的2倍，7 d组表达也明显高于对照组（P＜0.05）。

从趋势上来看（图10），Ampkα2、Bnip3、Nix mRNA变化趋势与其蛋白表达基本吻合，三者均呈开口向下的抛物线，从损伤至伤后12 h 就达到峰值，其峰值延续到伤后2 d，形成一个小平台期，此后形成斜率较小的下降期直至接近正常值；而伤后12 h骨骼肌中HIF-1α蛋白表达量已达峰值，而此时其mRNA 却仍接近正常，且其峰值仅在伤后2 d一个取材点出现，并不呈现一个小平台期，之后便开始下降直至恢复至正常水平。

图9 不同组别Nix mRNA表达柱状图

图10 不同取材时间点各mRNA表达变化趋势图

2.3 钝挫伤后腓肠肌超微结构及线粒体自噬体变化情况

对照组（图c-1、c-2）：肌纤维排列规律完整，无胞膜的破损，Z线清晰连续无断裂，M线、明暗带较清晰且区域明确，Z线附近可见到长椭圆形的线粒体。

损伤后12 h 组（图12h-1、12h-2）：由图12h-1（×6000）可见，肌纤维大量断裂、破损，排列凌乱，Z线完整性缺失，线粒体变圆、肿胀，甚至有空泡化表现；局部高倍（×50000）观察，线粒体嵴模糊不清，出现线粒体自噬体，自噬体由膜结构包裹和半包裹线粒体组成，有的被包裹线粒体内部染色较深，少数被包裹线粒体内部染色变浅呈现空泡状，在单个网孔视野中即可见到多个自噬体。

伤后2 d 组（图2d-1、2d-2）、5 d 组（图5d-1、5d-2）、7 d 组（图7d-1、7d-2）组：2～7 d 时腓肠肌超微结构较为接近，表现为肌纤维断裂仍然较多，但肌纤维的排列在伤后7 d组有明显的改善，三组肌纤维的Z线仍有断裂，线粒体数量明显增多，但正常线粒体形态较少，线粒体肿胀、空泡仍明显；局部高倍视野（×30000～70000）下可观察到清晰的被膜包裹、半包裹的线粒体，单个网孔视野中即可见到数量较多的自噬体。

损伤后10 d 组（图10d-1、10d-2）：肌纤维仍存在断裂，但形态上排列趋于规则，破损胞膜逐渐修复，Z线仍不够完整，有断裂表现，但整体改善明显；线粒体数量仍然多于正常对照组，且形态更多表现为椭圆形，但正常形态线粒体开始增多；提高放大倍数后（×10000）视野中可见较多被膜包裹的线粒体结构，但自噬体数量比钝挫伤后12 h～7 d组相比呈现减少趋势。

伤后15 d（图15d-1、15d-2）、30 d（30d-1、30d-2）：（×6000）肌纤维相对完整，15 d组虽然仍有少数断裂肌纤维，但相邻两断端之间有染色较深物质填充，可能形成瘢痕，而30 d 组仅有少数肌纤维仍能看到断裂端；肌纤维排列更加规整、有条理，Z线更加整齐完整；虽然仍存在一定数量的椭圆形线粒体，但正常形态线粒体增多接近正常对照组。高倍视野（×40000～50000）下，肌原纤维完整、清晰，排列较规整；但仍观察到极少数被膜包裹、半包裹的线粒体，即自噬体的存在。

图11 钝挫伤后腓肠肌超微结构及自噬体变化图（×5000～70000）

3 讨论

3.1 腓肠肌钝挫伤对HIF-1α、AMPKα2、BNIP3、NIX 表达影响

骨骼肌钝挫伤后肌组织被破坏，血管损坏、细胞破损、炎细胞浸润、炎性因子聚集、线粒体肿胀破坏等病理性改变，导致ATP生成障碍，AMP/ ATP 的比值升高诱发肿瘤抑制激酶LKB1-STRADα/β-MO25α/β复合物生成，激活缺氧应激因子脯氨酸羟化酶（PHDs），从而激活AMPK[19，20]。而AMPK作为上游关键信号因子对诱导低氧诱导因子HIF-1促进机体和细胞产生低氧适应具有调节作用，因此钝挫伤后AMPK表达可能与HIF-1表达出现同步[21，22]。本研究中，Hif-1α mRNA在伤后第二天表达出现峰值，与对照组有非常显著性差异（P＜0.01），伤后第5天表达有下降趋势，但仍较对照组有显著升高（P＜0.05），伤后第7 天表达回落正常；而Ampkα 2 mRNA从伤后12 h表达较对照组有非常显著的升高且达到峰值，该趋势一直延续至伤后第2 天，伤后第5天表达虽显著高于对照组，但表达却呈下降趋势，伤后第7天表达回归正常水平至伤后30天。蛋白HIF-1α、AMPKα2表达折线图趋势说明12 h、2 d两取材点为整个恢复过程中表达的峰值，伤后10 d，HIF-1α表达均明显高于对照组（P＜0.05），伤后15 d后HIF-1α表达接近正常；而AMPKα2 仅在伤后5 d 表达仍显著高于对照组（P＜0.05），自伤后10 d 起，表达回归至正常水平。我们的研究表明腓肠肌钝挫伤恢复过程中，HIF-1α、AMPKα2变化趋势同前人研究的组织病理变化具有一定关联性[23，24]。在骨骼肌钝挫伤恢复过程中，HIF-1α、AMPKα2 表达在伤后12 小时和2 天内维持最高表达，说明此时是受损组织缺氧和能量障碍最为严重的应激反应期。之后，即第5天时，虽然二者的表达均显著高于对照组，但已明显下降，说明损伤5 天后，缺氧和能量障碍的状态已缓解。至第7天，AMPKα2的表达恢复至正常水平，说明此时ATP 产生已趋于正常，而HIF-1α的表达是损伤后15天时趋于正常水平，说明伤后15天组织供氧已恢复。结合病理学，即钝挫伤后5d，炎性浸润开始消退，新生血管开始向损伤组织内长入[23]，此时缺血缺氧有所改善，ATP 生成有所增加，HIF-1α、AMPKα2表达量开始下降。

BNIP3、NIX 是定位在线粒体外膜的、受缺氧诱导表达、参与线粒体自噬过程的一类基因。钝挫伤诱发的缺氧导致了缺氧诱导因子HIF-1α表达升高，诱发下游因子BNIP3、NIX的表达升高。随着自体损伤修复进行，局部改善损伤部位的缺氧环境，过表达的BNIP3和NIX通过介导线粒体内溶酶体蛋白的沉积从而促进线粒体完整性[25]，同时BNIP3和NIX可诱导线粒体自噬和细胞凋亡的发生[18，26]，控制线粒体质量，从而促进钝挫伤修复过程。我们的结果显示：BNIP3、NIX 在骨骼肌钝挫伤伤后恢复过程中，表达量的变化趋势非常接近，在伤后12 h 即出现峰值。BNIP3 蛋白的表达自伤后5 d开始下降直至伤后10 d，但其间仍高于对照组，伤后15 d后回归正常水平；NIX的表达于伤后5 d、7 d两取材点仍高于正常，自伤后10 d开始至伤后30 d归于对照；BNIP3、NIX 的mRNA 变化情况与其蛋白表现相符。本研究中，BNIP3、NIX的表达于伤后2天内保持峰值，之后下降，直至10～15 天恢复至正常水平，这与HIF-1α的表达变化相一致，说明损伤后缺氧诱导了线粒体自噬的发生。伤后10～15天内，机体完成了受损线粒体的清除，有效的对线粒体质量进行了控制。

3.2 钝挫伤后自噬体发生与基因表达同步性分析

Fisher 等[27]早在1990 年就观察并描述了骨骼肌钝挫伤恢复过程中微观结构的变化。本研究在前人研究基础上重点对钝挫伤后线粒体形态、数量、自噬体形成等进行描述，发现12 h 后线粒体自噬体开始出现，伤后2 d、5 d、7 d 组线粒体数量明显增多，但正常线粒体形态较少，线粒体肿胀、空泡仍明显，单个网孔视野中即可见到数量较多的自噬体，说明在此期间线粒体网状结构尚未完全恢复，线粒体仍处在自噬发生阶段。损伤后10 d出现较多被膜包裹的线粒体结构，说明线粒体结构开始重建，自噬体数量趋于减少。

本研究结果显示，钝挫伤后线粒体自噬体在12 h～7 d 是线粒体自噬发生较为活跃的阶段，这与前人的研究结果一致[28]。另外，结果显示自噬体形成、发生与自噬相关蛋白BNIP3、NIX 的表达具有一定的同步性，即12 h～7 d期间BNIP3、NIX 表达明显增高，说明线粒体自噬水平出现显著提高，而电镜结果印证了上述mRNA 和蛋白水平的结果。同时，HIF-1α、AMPKα2表达也显著增高，说明钝挫伤后炎症浸润、局部血肿造成局部缺氧环境产生了骨骼肌能量代谢危机[25，29]。另外，BNIP3、NIX介导的线粒体自噬直接受到HIF-1α的调节，本研究结果HIF-1α、AMPKα2、BNIP3、NIX 表达增高说明在钝挫伤发生后12 h～7 d局部ATP 产生不足，同时缺氧明显，HIF-1α直接调控BNIP3、NIX 表达升高介导线粒体自噬发生。在钝挫伤修复过程中线粒体形态和数量在12 h～7 d 发生明显改变，其机制可能是损伤后局部线粒体发生过程被激活。钝挫伤发生后局部受损骨骼肌产生ATP 水平降低，导致AMPKα2高表达从而诱导线粒体发生[30，31]。因此，骨骼肌钝挫伤后能量调节关键因子AMPKα2、缺氧敏感因子HIF-1α、线粒体自噬诱导蛋白BNIP3、NIX表达均显著增加，且呈现与时间相关的变化，间接反映了损伤后缺氧环境发生与改善，诱导线粒体自噬，清除破损细胞器、线粒体从而加速损伤部位线粒体重建，加速钝挫伤的伤后恢复过程。

4 总结

（1）骨骼肌钝挫伤发生后，损伤早期代谢调控因子AMPKα2、缺氧敏感因子HIF-1α 损伤变化情况表明损伤后受损骨骼肌内部出现能量危机、并形成缺氧环境。另外，能量供应的恢复要早于氧供应的恢复。

（2）线粒体自噬、细胞凋亡相关因子BNIP3、NIX表达变化表明损伤后线粒体自噬被启动，缺氧诱导了骨骼肌钝挫伤早期的线粒体自噬。损伤后线粒体质量控制的完成要迟于能量供应的恢复，但与氧供应的恢复基本同步。由此我们推测，钝挫伤后有氧呼吸受阻，机体可能存在其他的能量供应代偿途径。

（3）缺氧诱导的线粒体自噬可及时清除受损线粒体，维持线粒体质量、为新生线粒体提供原料，从而减小损伤程度，以利于受损骨骼肌的快速恢复，这可能是损伤发生后机体的一种代偿性机制。