肩袖肌腱损伤动物模型的建立及初步研究

闫明童 翟申浩 褚国庆 丛文斌 于腾波

1 青岛大学医学院附属医院运动医学科（青岛266003）

2 青岛大学医学院附属医院骨科 3 青岛大学医学院附属医院放射科

肩袖亦称为旋转袖，是覆盖于肩关节前、上、后方之肩胛下肌、冈上肌、冈下肌、小圆肌等肌腱组织的总称。肩袖的功能是在上臂外展过程中，使肱骨头向关节方向拉紧，维持肱骨头与关节盂正常的关节结构。因此，肩袖肌腱损伤（rotator cuff tendon injury）时，肩关节外展功能受限，临床上肩袖肌腱损伤多见于冈上肌[1]。

研究肩袖损伤的动物多见有鼠、兔、羊、犬类[2-7]。大鼠关节较小，手术操作难度高，术后观察困难；羊及狗类动物生长周期长，实验花费高，难以大量研究。兔肩胛下肌穿过肩胛骨的一拱形凸起类似于人冈上肌穿过肩峰的结构（图1），因此兔肩胛下肌的解剖结构与人的肩袖结构更为相似。在组织学上，兔肩袖肌腱有着与人类相似的从肌腱到骨的移行区域，适合进行肩袖愈合的相关研究。因此，本研究通过建立兔肩袖损伤动物模型并验证其可行性，进行肩袖损伤初步生物力学、组织学研究。

图1 兔肩关节解剖

1 材料和方法

1.1 实验材料

本研究于2018年3月～8月在青岛大学医学部动物实验室完成。40只体重2.5～3.5 kg 的成年雄性新西兰大白兔由青岛大学动物实验中心提供；西门子核磁共振断层扫描仪（SIEMENS Magnetom，Verio 3.0T）由青岛大学附属医院提供；美国Instron-3300 万能材料试验机由青岛大学提供。

1.2 实验方法

1.2.1 兔肩袖损伤模型建立及实验过程

40 只成年雄性新西兰大白兔随机编号，选取4 只兔，其中2 只用于测试生物力学仪器，另外2 只用于调试兔肩袖MRI设备。这4只兔的实验数据不计入实验结果中，只用于前期准备及调试工作。其余36 只大白兔选取右侧肩胛下肌为实验侧，对侧作为假手术对照。用3% 的戊巴比妥钠（1 ml / kg）行耳缘静脉缓慢推注，观察兔的生命体征，待兔角膜反射及皮肤夹捏无反应后视为麻醉成功。麻醉后将兔固定于动物手术台，常规备皮、消毒、铺无菌巾。在肩关节外侧行长约2cm 的纵行切口，钝性分离三角肌，显露肩胛下肌肌腱在小结节上的止点（见图2A），兔肩胛下肌止点处平均宽度为6.8 mm[8]（图2B）。于肱骨小结节止点处锐性离断约2～3 mm（＜50%止点处肌腱宽度）的肩胛下肌肌腱。检查伤口无活动性出血后，逐层关闭伤口，无菌纱布覆盖，绷带固定。对侧肢体做假手术对照，显露肩胛下肌后不做处理，随后逐层关闭伤口，无菌纱布覆盖，绷带固定。术后常规观察直至兔自然苏醒，常规饮食，手术切口2～3 天更换敷料，青霉素4×105 U 后肢肌注预防感染，持续3 天。术后单笼限制性饲养（60 cm×40 cm×50 cm），手术侧及对侧均不进行制动固定。

图2 肩胛下肌损伤模型的建立

1.2.2 检测方法

1.2.2.1 观察指标

动物模型的建立是否成功，手术操作的可重复性；术后2、4、6、8 周实验动物恢复情况，手术切口有无感染；实验动物肌腱愈合情况。

1.2.2.2 生物力学测试

术后2、4、6、8 周各选取5只实验兔子，以右侧肩胛下肌止点为中心，截取整块右侧肩胛下肌及近端肱骨，按相同方法获取对侧肩胛下肌。在正式实验开始前，选取未进行任何处理的2只兔的肌腱进行预实验，实验标本肌腱侧采用“三明治”（砂纸-万能胶-肌腱-万能胶-砂纸）方法固定[9]，肱骨头端直接固定于仪器上，确保在到达最大拉力时，肌腱撕裂部位为肌腱或腱骨结合处而非肌腱侧或肱骨头侧从仪器上脱落。调整合适的固定后进行生物力学测试，减少因固定方法不当而造成的误差。进行生物力学实验时，按预实验的方法固定标本，在美国Instron-3300 万能材料试验机上进行拉力测试，载荷率为0.4 mm /s，详细观察记录肩胛下肌肌腱被拉断时的加载负荷并作为最大载荷（N）。

1.2.2.3 组织病理学观察

术后2、4、6、8周各选取3只实验兔子，以右侧肩胛下肌止点为中心，截取包括肱骨小结节组织和距肩胛下肌止点2 cm 处的肌腱组织，用于观察肌腱愈合情况。标本以体积分数10%甲醛溶液固定3 d，以体积分数30%甲酸溶液充分脱钙4 周后，水冲12 h 以去除标本中残留的甲酸，然后以体积分数10%甲醛溶液再次固定，经AF 液（体积分数10%甲醛溶液和体积分数95%乙醇按1∶1 的比例配制）和梯度乙醇脱水、二甲苯透明后，石蜡浸蜡、包埋，制成4 μm 厚度的连续切片。分别进行HE染色、Masson染色后光镜下观察肩胛下肌损伤后肌腱愈合的形态学变化。

1.2.2.4 核磁共振（MRI）检查

选取正常兔子2只用于实验测试前调试核磁共振机器。待机器调整合适后，术后2、4、6、8 周各选取实验兔子2 只，对选取的大白兔用3%戊巴比妥（ 1 ml/ kg ）耳缘静脉注射进行麻醉，然后将其以上肢向内的卧位平放于动物固定线圈上（图3），放入核磁共振断层扫描仪器中，采集肩关节处图像。图像采集结束后，等待兔子自然苏醒后放回笼中饲养。

1.3 统计学方法

用SPSS 17.0 统计软件对实验数据进行处理，所有数据以x ± s 表示，组间均值比较采用独立样本t 检验，组内比较采用单因素方差分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

图3 核磁共振所用动物线圈及实验动物体位

2 结果

2.1 实验动物造模结果

除4 只未进行实验操作的兔外，其余36 只实验动物兔，4 只死于实验麻醉；其余32 只术后情况良好，于手术结束自然苏醒后开始正常进食，术后实验兔无伤口感染及死亡。在进行手术操作建立动物模型的过程中，兔肩胛下肌解剖结构清晰，且其止点可于肱骨小结节处找到，手术操作相关部位解剖清晰，对肩胛下肌的手术操作相对简单易行，可以很好地模拟人肩袖肌腱损伤以及周围因素导致的肩袖损伤；肩袖损伤入路及手术操作的可重复性高[8]。

2.2 生物力学测试

实验观察撕脱部位，各肌腱撕脱部位均位于肌腱靠近肱骨处（图4），不存在肌腱从砂纸中撕脱或肱骨从机器上脱落。实验侧的最大载荷在2、4、6、8 周逐渐增加，差异有统计学意义（P＜0.01）。实验侧术后第8周最大载荷与假手术对照侧差异无统计学意义（P＞0.05）；实验侧术后2、4、6 周的最大载荷均低于假手术侧，差异有统计学意义（P＜0.05）（表1）。

图4 撕脱部位位于肌腱靠近肱骨处

表1 最大载荷比较（N，n=20）

2.3 组织病理学结果

HE染色可以大体观察肌腱结构，初步评价愈合情况。Masson 染色用于观察肌腱的胶原纤维分布，有助于评估肌腱的愈合情况（图5、6）。

术后2周，实验侧肌腱愈合不明显，肌腱内可见间充质细胞增生，大量疏松结缔组织和炎症细胞浸润，少量脂肪细胞，肌腱内胶原纤维排列不规则；术后4周肌腱内可见明显脂肪浸润，大量胶原纤维成束状排列；术后6周肌腱胶原纤维成簇状排列，结构紊乱，大量成纤维细胞和胶原纤维相连，仍然存在少量脂肪细胞；术后8周，肌腱内胶原纤维粗大而规则，排列紧密，基本恢复正常肌腱排列。

图5 兔实验侧肌腱组织HE染色（×100）

图6 兔实验侧肌腱组织Masson染色（×100）

2.4 核磁共振结果

术后2周，实验侧肌腱内可见局限性信号增强影，肌腱内结构不规则，肌腱外形欠佳，肩关节腔内可见信号增高影；术后4周肌腱内高信号影逐渐降低，肌腱外形不光滑，关节腔内信号增高影逐渐减少。术后6 周肌腱内高信号影减少，肌腱外形稍有不光滑影，关节腔内基本无高信号影。术后8周肌腱内基本不见高信号影，肌腱外形光滑，关节腔内少量高信号影（图7）。

图7 兔实验侧肩关节MRI检查结果

3 讨论

3.1 实验动物的选择

以往文献中研究肩袖肌腱损伤的实验动物有大鼠、兔、羊和犬。大鼠冈上肌解剖结构也存在一类似于人冈上肌肌腱通过肩峰的拱形结构[10]，因此部分实验选取大鼠为研究对象。但大鼠肩关节较小，手术操作难度大，术后观察比较困难。羊及犬类实验动物体型大，虽然肩关节结构与人相似，但在进行肩袖损伤模型建立术后，实验动物需要用前足支撑活动，影响术后观察效果；其次羊和犬类实验动物生长周期较长，饲养及管理花费高。因此本研究选取繁殖快、价格相对低廉、饲养及管理方便的兔为实验对象。在研究兔肩部解剖结构与人的肩部解剖结构中发现[11]，兔肩胛骨解剖结构与人存在一定差异，兔冈上肌肌腱并不存在类似于人的冈上肌肌腱穿过肩峰的部分，无法模拟人冈上肌部分损伤中存在的肩峰撞击。而对36 只实验兔进行手术及术后解剖发现，兔肩胛下肌在肱骨头止点前方存在一个穿过由肩胛骨凸起而形成的拱形结构的部分，止于肱骨小结节。肩胛下肌解剖位置明确，兔肩胛下肌止点可于肩关节外侧手术入路在肱骨头处寻找到，手术入路比较好选择。肩关节处皮下脂肪含量少，周围解剖结构清楚，手术操作对周边结构影响小，不损伤肩袖其余肌肉肌腱，建立肩袖损伤模型的操作及相关手术操作的可重复性高。在组织学上兔肩袖肌腱有与人相似的从肌腱到骨的移行区域，适合于研究肩袖肌腱的愈合。

在模型制备的过程中，虽然选取兔作为动物模型可以很好地模拟人肩袖损伤，但兔在行走及跳跃时，前足会着地，在实验中兔单笼饲养但并不限制其活动，因此容易造成术后肩袖肌腱因活动而导致的进一步损伤。但在实际饲养时观察发现，兔常用双下肢站立、双上肢持物，比其他实验动物上肢单独活动及避免上肢负重的时间更多[12]。同时观察兔术后活动发现，因手术疼痛影响，为减少上肢负重或活动引起的疼痛，兔本能的长时间站立，间接地减少因活动造成的进一步损伤，更利于观察肩袖在损伤后的恢复情况。因此本实验选取兔肩胛下肌来模拟人的肩袖损伤，进行肩袖损伤动物模型的相关研究。

3.2 生物力学测试

为了更好地进行测试，在选取实验材料时，应尽可能多地截取肩胛下肌肌腹，完整切取肱骨头，调整合适的固定后进行生物力学测试，减少因固定方法不当而造成的误差。最大载荷是指在最大拉力上的拉断载荷。本研究结果显示，实验侧最大载荷随着时间的延长而逐渐增加，且在前6 周实验侧最大载荷均低于假手术侧，差异具有统计学意义（P＜0.05）；第8 周实验侧最大载荷与假手术侧差异无统计学意义（P＞0.05）。这提示损伤肌腱在8周已基本恢复其生物力学强度。兔的这一生物力学特性证实兔适用于肩袖损伤研究[8]。

3.3 组织病理学及核磁共振分析

在进行组织学染色时选取的标本应尽可能保留损伤部位，留取一部分肱骨小结节，以便观察。在进行切片时尽可能切取损伤中心部位进行染色观察。损伤2周时HE染色显示实验侧肌腱愈合不明显，肌腱内可见间充质细胞增生，大量疏松结缔组织和炎症细胞浸润，少量脂肪细胞；Masson染色可见大量结缔组织，肌腱纤维排列紊乱；磁共振显示肌腱内高信号影，肌腱边缘不光滑。6周时肌腱在组织学及影像学上已趋于正常，核磁共振结果显示肩胛下肌肌腱内因损伤而导致的高信号影较少，肌腱边缘清楚。因此，在肩袖肌腱部分损伤后，特别是损伤小、不影响活动的损伤，可先进行保守治疗，6～8 周内，肌腱有愈合倾向。但肩袖肌腱损伤不可避免会有脂肪浸润和肌肉萎缩，本实验未见明显的脂肪浸润和肌肉萎缩，推测有可能与造成的损伤小，未引起严重的脂肪浸润有关。另外有研究表明，在兔的肩袖损伤实验中，未进行处理的冈上肌损伤中，脂肪浸润在6 周时最明显，肌腱在12 周时基本愈合且脂肪浸润在损伤处消失[4]。在进行肩袖损伤修复手术后，肩袖的脂肪浸润和萎缩变性可部分逆转[13，14]。

3.4 实验局限性

本次实验选取兔肩胛下肌可以更好地模拟人冈上肌穿行肩峰的这一特殊的解剖结构，但肩胛下肌与冈上肌在功能上存在差异；另外兔肩关节基本不进行外展活动，与人的肩关节活动范围存在一定差异，限制了肩袖损伤后的进一步研究[15]。本实验未进行防止肩袖损伤后脂肪浸润和肩关节粘连的研究，虽然有研究表明肩袖损伤后脂肪浸润并不妨碍肩袖损伤的修复，但本实验未加以证实[2，16，17]。肌腱损伤的同时多伴有神经损伤，而本研究仅考虑肌腱的自然愈合，未考虑神经因素对肌腱愈合的影响[18，19]。实验样本量较小也是影响实验结果的因素之一。

4 结论

本实验证实利用兔肩胛下肌建立肩袖损伤动物模型并进行相关实验研究的可行性。生物力学、组织病理学染色观察以及核磁共振结果显示兔肩袖肌腱部分损伤后，6～8周基本愈合，恢复肌腱生物力学强度；肌腱纤维排列紧密，基本恢复正常的肌腱纤维排列；影像学上损伤信号基本恢复。