复方雷公藤汤对肾病大鼠心脏减毒增效作用的实验研究❋

李 波，宋顺鹏，吴美兰

(1.大连市皮肤病医院中医皮肤科，辽宁 大连 116021；2.大连市中医医院 中医妇科，辽宁 大连 116013)

雷公藤是对风湿免疫疾病及肾病治疗有独特疗效的药物，但又对心血管系统、泌尿系统、血液系统、生殖系统等有明确的损害，限制了临床应用。中医治疗疾病是采用不同性味、功效的中药配伍组成复方来遣药组方。一些“有毒中药”(如雷公藤、附子等)在治疗疑难病症方面有独特疗效，但因其对机体的毒副作用而临床使用受到限制。综合中医七情相杀、调和药性、扶助正气配伍诸法，来减弱中药毒性是临床常用方法。中药配伍理论成为其主要的减毒依据，可使雷公藤减毒增效从而应用于临床[1]。雷公藤治疗很多难治性疾病疗效显著，但其副作用明显。本研究综合中医配伍诸法，传统的中医理论与现代疾病发病机制结合组成复方雷公藤汤，拆方实验干预肾病综合征，探讨配伍减毒增效的可行性，筛选最佳药物组合[2]。增效方面以肾病大鼠24 h尿蛋白、白蛋白(ALB)、总蛋白(TP)、甘油三酯(TG)、胆固醇(chol)为指标，对心脏减毒以肌酸激酶(CK)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)为考察指标，并考察不同配伍对肾脏、心脏组织形态和超微结构的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

选取普通级Wister大鼠110只(辽宁中医药大学实验动物中心提供)，7～8周龄，体质量(200±10)g，均为未曾交配雌性(动物合格证号SCXK(辽)2004-0016)。按完全随机化原则分为11组，其中肾病模型组9组(雷公藤组、雷芪组、雷归组、雷何组、全方组、雷金组、雷甘组、强地松组、模型空白组)，空白组2组(正常空白组、正常公藤组)，每组10只，分笼饲养。

1.2 药物与试剂

中药雷公藤(福建)为卫矛科植物雷公藤Tripterygium wilfordii Hook.f.的全株，甘草(内蒙)为豆科多年生草本植物Glycyrrhiza glabra L.的根及茎，黄芪(内蒙古)为豆科多年生草本植物蒙古黄芪Astragalus membranaceus(Fisch.)Beg.Var.的根，何首乌(四川)为蓼科多年生缠绕草本植物何首乌Polygonum multiflorum Thunb.的块根，当归(甘肃)为伞形科多年生草本植物当归Angelica sinensis Diels的根，金钱草(浙江)为报春花科多年生草本植物过路黄Lysimachia christinae Hance的全草，购于沈阳天益堂药房。醋酸泼尼松5 mg/片，100片装/瓶(天津太平洋制药有限公司，批号060401)；注射用盐酸阿霉素10 mg/只，5只装(浙江海正药业股份有限公司，批号060504)；生理盐水500 ml/瓶(锦州九泰药业有限责任公司，批号0609022)；20%乌拉坦，辽宁中医药大学临床药理基地提供；75%酒精500 ml/瓶(沈阳市富康消毒药剂厂，批号20070518)；甲醛固定液由辽宁中医药大学病毒室提供；戊二醛固定液由中国医科大学第二电镜室提供。

1.3 主要仪器

全自动生化仪(BECKMAN-CX3美国)；光镜Olympus,Japan；电镜JEM-1200EX；LKB-I型超薄切片机；ES-J系列电子分析天平(沈阳龙腾电子称量仪器公司)；Sigma冷冻离心机。

1.4 模型制备与给药

参照Fermandez-Llama等[3]方法，造成其形态学改变和临床表现与人的微小病变相似肾病模型，采用一次性尾静脉注射阿霉素复制。模型组：非麻醉下按6.5 mg/kg体质量一次性尾静脉注射阿霉素(2%阿霉素0.65 ml)。模型评估：造模3 d后大鼠逐渐出现食欲减退、行动迟缓、皮毛无光泽、厮咬、烦躁、腹水。造模第7天后用代谢笼收集24 h尿液测尿蛋白定量，呈渐进性增多，与文献报道一致则造模成功。空白组：同法注射0.65 ml生理盐水。复方雷公藤汤(全方)及拆方：6味中药按体表面积换算法，D鼠=D人×R鼠/R人，确定各味药物的剂量。全方、拆方各药剂量均相同：雷公藤60 g，甘草19.6 g，当归19.6 g，何首乌39.2 g，黄芪49 g，金钱草68.6 g。其中雷公藤方雷公藤60 g，雷何方中雷公藤60 g，何首乌39.2 g，雷归方中雷公藤60 g，当归19.6 g，雷芪方中雷公藤60 g，黄芪49 g。全方中雷公藤60 g，何首乌39.2 g，黄芪49 g，当归19.6 g，甘草19.6 g，金钱草68.6 g；雷金方中雷公藤60 g，金钱草68.6 g；雷甘方中雷公藤60 g，甘草19.6 g。各方入水量2000 ml，雷公藤先煎1 h后下诸药，常规煎煮2次，去药渣后合并药液浓缩成300 ml。各方含生药量：雷公藤方0.2 g/ml，雷何方0.33 g/ml，雷归方0.264 g/ml，雷芪方0.363 g/ml，全方0.853 g/ml，雷金方0.428 g/ml，雷甘方0.264 g/ml。各组从造模第15天起开始经口灌药2 ml，每日1次，共给药2周。强地松组5 mg/kg灌胃2周。

1.5 观察指标

1.5.1 生化检测 打开腹腔剥离脏器，暴露腹主动脉，用10 ml注射器抽取6 ml动脉血，离心3500 r/10 min，取血清2 ml送生化室用BECKMAN-CX3全自动生化仪检测血脂、血浆蛋白、肌酸激酶、肌酸激酶同工酶指标。

1.5.2 组织形态学光镜 打开胸腹腔后取左肾、心脏，标本用10%甲醛固定，组织块修整、洗涤、脱水、透明、包埋、HE染色、封固，显微镜下观察。

1.5.3 超微结构电镜 打开胸腹腔后用锋利的解剖刀剪取左肾、心脏一小块组织，放在预冷的3%戊二醛固定液中，锋利刀片切成1 mm3小块。缓冲液清洗，1%锇酸后固定、缓冲液清洗、酒精梯度脱水、浸透、包埋、聚合、超薄切片、染色，透射电镜下观察。

1.6 统计学方法

2 结果

2.1 各组大鼠干预前后对尿蛋白的影响

表1显示，模型组治疗前、1周、2周后24 h尿蛋白较正常组均升高(P<0.01)，正常公藤组治疗1周、2周后24 h尿蛋白较正常组升高(P<0.01)，各治疗组治疗1周后24 h尿蛋白较模型空白组降低(P<0.05)，2周后较模型空白组降低(P<0.01)，治疗组中全方组、雷芪组、强地松组、雷甘组治疗1周后24 h尿蛋白较治疗前均降低(P<0.05)，2周后较治疗前均降低(P<0.01)，治疗组中雷金组、雷何组、雷归组治疗2周后24 h尿蛋白较治疗前均降低(P<0.05)，起治疗作用。治疗组中全方组、雷芪组、雷甘组治疗2周后24 h尿蛋白较模型公藤组均降低(P<0.05)，起增效作用。

2.2 各组大鼠干预后对血浆蛋白、血脂、肌酸激酶、肌酸激酶同工酶的影响

模型组中空白组较正常空白组TP降低(P<0.05)，ALB降低(P<0.01)，CHO、TG、CK、CK-MB升高(P<0.01)，说明阿霉素对心脏有毒性作用。模型公藤组较正常空白组TP、ALB降低(P<0.05)，CHO、TG、CK、CK-MB升高(P<0.01)，治疗组中全方组、雷芪组、雷甘组TP、ALB较模型公藤组升高(P<0.05)，chol、TG较模型公藤组降低(P<0.01)，治疗组中雷金组、雷何组、雷归组chol、TG较模型公藤组降低(P<0.05)，治疗组中全方组、雷何组、雷芪组、雷甘组CK、CK-MB较模型公藤组降低(P<0.01)，治疗组中雷归组、雷金组CK、CK-MB较模型公藤组降低(P<0.05)起到增效作用。治疗组中全方组、雷何组、雷芪组、雷甘组CK、CK-MB较雷归组、雷金组降低(P<0.05)，治疗组中全方组、雷何组、雷芪组和雷甘组对抗雷公藤心脏毒性较雷归组和雷金组好。模型公藤组CK、CK-MB较模型空白组升高(P<0.01)，正常公藤组CK、CK-MB较正常空白组升高(P<0.01)，雷公藤在病理生理状态下对心脏有毒性作用。

表1 各组大鼠干预前后尿蛋白变化情况比较

注:与模型空白组比较：aP<0.05，bP<0.01；各组自身前后比较：cP<0.05，dP<0.01；与模型公藤组比较：eP<0.05；与正常组组比较：fP<0.01

表2 各组大鼠干预后血浆蛋白、血脂、肌酸激酶、肌酸激酶同工酶比较

注:与模型空白组比较：aP<0.05，bP<0.01；与正常空白组比较：cP<0.05；dP<0.01；与模型公藤组比较：eP<0.05，fP<0.01；与雷金组比较：gP<0.05

2.3 肾脏组织形态学改变

图1、2显示，HE 染色光镜观察，模型公藤组:肾小球基质稍增多，肾小管空泡变性，远端肾小管扩大，肾间质中度弥漫性水肿,轻度灶性纤维化和炎细胞浸润；雷何组:肾小球毛细血管壁变薄，远端肾小管扩大，上皮细胞增大，肾小球基质稍增多不明显；各配伍组：肾小球毛细血管壁变薄减轻，基底膜轻微增厚，上皮细胞增大不明显，系膜细胞轻度增生；透射电镜观察，模型公藤组：肾小球束壁黏连，足细胞部分溶合。足细胞表面微绒毛化，其胞质内线粒体空泡变性，肾小球足细胞广泛融合，其胞质内线粒体较多，粗面内质网扩张，足细胞表面微绒毛化，毛细血管腔内见有红细胞；各配伍组：肾小球束壁、毛细血管腔、足细胞病理改变均有减轻[4]。

注：A.模型公藤组；B.雷何组；C.雷归组；D.雷芪组；E.全方组；F.雷金组；G.雷甘组；H.强地松组；I.模型空白组；J.正常空白组；K.正常公藤组图1 光学显微镜下各组大鼠肾组织比较(苏木精和伊红染色 ×200)

注：A.模型公藤组；B.雷何组；C.雷归组；D.雷芪组；E.全方组；F.雷金组；G.雷甘组；H.强地松组；I.模型空白组；J.正常空白组；K.正常公藤组图2 电子显微镜下各组大鼠肾组织形态变化比较(×6000)

注：A.模型公藤组；B.雷何组；C.雷归组；D.雷芪组；E.全方组；F.雷金组；G.雷甘组；H.强地松组；I.模型空白组；J.正常空白组；K.正常公藤组图3 光学显微镜下各组大鼠心组织比较(苏木精和伊红染色 ×200)

注：A.模型公藤组；B.雷何组；C.雷归组；D.雷芪组；E.全方组；F.雷金组；G.雷甘组；H.强地松组；I.模型空白组；J.正常空白组；K.正常公藤组.图4 电子显微镜下各组大鼠心组织形态变化比较(×6000)

2.4 心脏组织形态学改变

图3、4显示，HE 染色光镜观察，模型公藤组:心肌细胞排列紊乱，肌间隙变宽，部分心肌肌原断裂，部分肌源纤维溶解；各配伍组：心肌细胞排列整齐，心肌间隙无明显增宽；透射电镜观察，模型公藤组:肌纤维局部溶解、断裂，并伴有肌纤维水肿，肌间线粒体量较多，其嵴有溶解多呈水肿空泡样变性，有的线粒体外膜破坏，肌质网轻度扩张，肌纤维多处溶解、断裂；各配伍组：肌纤维、肌间线粒体病理改变较模型公藤组明显减轻。

3 讨论

近年来，以“马兜铃酸肾毒性”和“鱼腥草注射液不良反应”为代表的中药毒性事件，引起社会的巨大反响和广泛关注，使得中药在治疗各项疾病时的安全性备受关注[5]。历代医家采用配伍、炮制、调节用量、煎煮、服法等方法对有毒中药实施减毒增效，而其中配伍减毒法又派生相杀、调和、解毒、佐制、扶正等减毒法[6]。复方雷公藤汤据诸法组合而成，方含雷公藤20 g，生甘草10 g，炙黄芪25 g，金钱草35 g，酒当归10 g，制何首乌20 g，功用益气养血、解毒化浊、利水消肿。以雷公藤活血解毒、消肿除湿为君药；黄芪、当归和何首乌三药补气血扶正、益精血，以防雷公藤戕伐之害共为臣药；金钱草利水消肿、清热解毒，助君药之力兼杀其毒为佐药；甘草补中益气以扶正、解药毒缓君药之性，另可调和诸药，故为使药。甘草是最常用的中草药之一，具有清热解毒、保肝抗炎和调和诸药等功效，黄芪与雷公藤配伍可显著减轻雷公藤所致心损伤[7]。前期已做复方雷公藤汤及拆方对肾病大鼠血液系统的减毒增效作用研究。实验结果表明，雷公藤配伍后可起到减低雷公藤对血液系统毒性的作用[8]。

实验结果表明，在减少24 h尿蛋白、提高血浆蛋白、降血脂方面，雷芪组和雷甘组效果较其他配伍组为优，考虑是黄芪和甘草具有免疫调节和类似皮质激素样作用。正常公藤组2周后出现尿蛋白，较正常空白组有统计学意义，表明长期服用雷公藤对肾脏确有毒性[9]。在保护心肌、降低CK、CK-MB方面，雷何组、雷芪组、雷甘组较雷归组、雷金组效果好。现代药理实验证实，黄芪对缺氧缺糖条件下培养心肌细胞具有明显的保护作用，可加强心肌细胞的代谢及补偿能力。

国内雷公藤减毒增效研究表明，雷公藤各部位的采摘季节以秋季为佳，临床药用部位主要为根及根茎[10]。孙龙等[11]确定了三七、地黄在清络通痹精简方中起到降低雷公藤毒性的作用。秦思等[12]研究结果表明，雷公藤多苷配伍黄芪总皂苷使用可显著减轻佐剂性关节炎大鼠的关节炎症状，是通过降低血清中炎症因子水平达到的，并具有减毒增效的作用。周玲玲等[13]将雷公藤分别与生地黄、青风藤、僵蚕、三七配伍。雷公藤复方配伍不同功效药物影响雷公藤的体内代谢过程和体内物质的代谢过程，达到配伍减毒的目的，是可调节肝细胞色素P450酶的含量，差异调控肝细胞色素P450酶不同亚型的表达取得的。唐利宇等[14]]考察黄芪配伍雷公藤前后的雷公藤毒性成分的含量变化，证实黄芪与雷公藤配伍可降低其毒性，并结合中药七情中“相畏相杀”理论，采用高效液相色谱法比较分析黄芪配伍雷公藤前后毒性成分雷公藤内酯酮含量变化，从化学成分层次分析其减毒的物质基础变化。

总之，雷公藤是一种独特疗效的中药，兼具很好的治疗作用和巨大的毒副作用。如何扬长避短，使雷公藤的疗效大幅度提高，同时又降低其毒性是今后对雷公藤进行深入研究的方向[15]。由文献可知，传统的炮制、配伍减毒、剂型改革和结构修饰，再到高分子技术与生物技术的应用，均旨在最大限度地减少雷公藤自身在治疗疾病过程中产生的毒副作用，并增强其疗效[16]。复方雷公藤汤及拆方对肾病大鼠确有减毒增效的作用，其降低肾病尿蛋白、血脂，升高血浆白蛋白，起到增效作用；在对抗雷公藤心脏毒性方面都筛选出最佳配伍。具体说来，治疗肾病增效方面,全方、雷芪组、雷甘组为佳，减低心脏毒性则以全方、雷芪组、雷何组、雷甘组为佳，全方组为毒效最优化复方，为本方临床应用和新药开发提供了前期研究基础。目前中药减毒实践中应用最为有效和广泛的方法仍然是炮制、配伍减毒法，具有广泛的应用性。对中药减毒方法的研究，要想取得突破性进展，应该在中医药理论指导下，引入多学科、多途径、多手段，结合体外和体内实验，为临床合理用药提供理论和实践依据[17]。要在中医药辨证论治和整体观念的指导下，通过中药配伍发挥减毒作用，展示其“多靶点”整体作用的治疗优势。中药配伍减毒的研究需将传统的中医理论与保护雷公藤毒性靶标的药物结合，深入开展雷公藤配伍减毒机制研究，筛选出雷公藤毒效关系最优化的中药小复方，提高肾病、皮肤病、类风湿关节炎等难治疾病的治疗效果[18]。