复方片仔癀肝宝调控MicroRNA-155及IL-6、IL-10防治肝损伤的分子机制研究❋

伍 娟，刘 赟，赵锦燕，楼 莹，李 煌，洪振丰△

(1.福建中医药大学临床技能教学中心，福州 350122；2.福建中医药大学中西医结合研究院，福州 350122；3.福建中医药大学药学院，福州 350122)

肝损伤是由于手术打击、创伤、微生物感染、肝脏疾病、有毒化合物、药物毒副作用、免疫紊乱、遗传变异、代谢失常、理化刺激等导致的肝细胞、肝组织甚至整个肝脏器官的形态与功能的病理改变[1]。肝损伤是慢性肝病重要的病理性特征，是严重危害人类健康的世界性问题，是治疗慢性肝脏疾病的关键环节。目前国内外尚无理想的抗肝损伤药物，因此寻找有效药物阻断、延缓及逆转肝损伤的发生发展在肝病的治疗中有重要意义。理想的抗肝损伤药物应具有良好的耐受性，对肝脏有特异的靶效应，无毒或者低毒，天然药物及中草药在这方面具有得天独厚的优势。复方片仔癀肝宝主要成分为茵陈、龙胆、栀子、蛇胆、牛黄、白芍、三七、麝香、甘草等，是漳州片仔癀药业有限公司在香港上市的保肝产品，具有清肝利胆、利湿退黄、活血祛瘀等功效。课题组前期研究表明，片仔癀肝宝具有防治肝损伤的作用[2-6]。本文旨在探讨片仔癀肝宝靶向调控miR-155及其下游靶基因IL-6、IL-10的表达，研究其对肝损伤的保护作用机制，为片仔癀肝宝临床用于防治肝损伤奠定实验基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SD大鼠60只，体质量(200±20)g，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供(许可证号SCXK，沪2017-0005，批号2015000544478)。

1.2 主要药品与试剂

复方片仔癀肝宝(GB)由片仔癀药业有限公司提供(批号1405005)；西利宾胺(江苏中兴药业有限公司，批号国药准字H32026145)。AST试剂盒购自南京建成生物工程研究所(批号20171229)；ALT试剂盒购自南京建成生物工程研究所(批号20180104)；IL-6、IL-10大鼠酶联免疫吸附试验试剂盒购自北京百奥思科生物医学技术有限公司 (批号20170826)；四氯化碳，分析纯，国药集团化学试剂有限公司(批号20130514)；SYBR Green q PCR Super Mix(ABI-invitrogen公司)；目的基因引物DNA(北京百奥思科生物医学技术有限公司)。

1.3 主要仪器设备

qPCR仪(7500/7500 Fast Real-Time PCR System，美国ABI公司)；台式高速冷冻离心机(64R，美国Beckman Allegra公司)；APC 300 电泳仪(美国BioRad 公司)；酶标仪(ELX808，德国宝特公司)等。

1.4 实验方法

1.4.1 动物造模、分组及给药 雄性SD大鼠60只,体质量(200±10)g,按随机数字表法分为空白对照组、模型组、阳性药物对照组(西利宾胺20 mg/kg)、复方片仔癀肝宝高剂量组(600 mg/kg)、复方片仔癀肝宝中剂量组(300 mg/kg)、复方片仔癀肝宝低剂量组(150 mg/kg)每组各10只。各实验组按照不同剂量灌胃给药0.5 ml/100 g,连续7 d,每日1次。除空白对照组外其他5组大鼠末次给药1 h后，按2 ml/kg给予50%CCL4花生油溶液腹腔注射造模，空白组腹腔注射2 ml/kg花生油。

1.4.2 取材 腹腔注射CCL4，24 h后称重，用3%戊巴比妥钠60 mg/kg腹腔注射麻醉后，腹主动脉采血处死，取肝脏称重。分离血清，-20 ℃保存，用于测定血液生物化学指标；迅速分离整个肝脏，称重，然后取右叶肝组织1×1×1 cm3，用4%多聚甲醛固定，用于形态学检测。

1.5 观察指标及检测方法

1.5.1 血清 ALT、AST测定 比色法检测大鼠血清中ALT、AST的活性，麻醉后腹主动脉采血，静置2 h后用离心机离心10 min(3000 r/min)取上清，按试剂盒说明书检测ALT、AST。

1.5.2 ELISA检测血清中IL-6、IL-10含量 大鼠血清以PBS进行5倍稀释，铝箔袋在室温平衡20 min后取出所需板条，设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加入50 μL不同浓度的标准品。样本孔先加入10 μL待测样本，再加入40 μL样本稀释液，空白孔不加。向标准品孔和样本孔中每孔各加入100 μL抗体，用封板膜封住反应孔，恒温箱温育60 min，空白孔不加。弃去液体，吸水纸拍干后向每孔加满洗涤液，静置1 min后，甩去洗涤液后再吸水纸上拍干，重复洗板5次。每孔各加入50 μL底物A、B，37 ℃避光孵育15 min。每孔各加入50 μL终止液，于15 min内在相应波长处测定各孔的OD值。绘制标准曲线，按曲线方程计算各样本浓度值。

1.5.3 肝组织病理学观察 取肝右中央叶多聚甲醛固定，梯度酒精脱水，二甲苯透明，制备石蜡切片，HE染色，光镜下观察肝组织病理改变。

1.5.4 Q-PCR法检测大鼠肝组织中miR-155和IL-6、IL-10表达水平 提取RNA：TRIZOL法提取总RNA，肝组织总RNA纯度及含量测定。Primer 5.0软件设计miR-155及下游靶基因IL-6、IL-10的引物(引物序列详见表1),用逆转录试剂盒把RNA逆转录成cDNA。miR-155实时定量PCR以U6为内参照(U6为一类核小分子RNA，由RNA聚合酶Ⅲ启动，定位于细胞核内，表达稳定，在检测基因表达水平变化时常用它做参照物，为通用的内参基因)，SYBRGreen实时荧光定量PCR扩增，扩增体系(20 μL)，具体步骤参见试剂盒说明书。以目的基因相对表达量作为判断标准，采用2-ΔΔCt的方法计算miR-155和IL-6、IL-10的相对表达量。

表1 引物序列

1.6 统计学方法

2 结果

2.1 复方片仔癀肝宝对血清中AST、ALT影响

表2显示，模型组大鼠血清ALT和AST显著高于正常组(P<0.01)；GB低剂量组、GB中剂量组、GB高剂量组、西利宾胺组大鼠血清ALT和AST水平显著低于模型组(P<0.01)。结果表明，西利宾胺、片仔癀肝宝均有降低大鼠转氨酶的作用。

2.2 复方片仔癀肝宝对血清中IL-6、IL-10的影响

表2显示，与正常组比较，模型组IL-6的表达显著升高(P<0.01)，IL-10的表达显著降低(P<0.01)。与模型组比较，复方片仔癀肝宝各剂量组和西利宾胺组IL-6的表达显著降低(P<0.01)，IL-10的表达显著升高(P<0.01)。结果表明，复方片仔癀肝宝对IL-6、IL-10表达有显著的调控作用。

表2 复方片仔癀肝宝对血清AST、ALT、IL-6、IL-10的影响

注：与正常组比较：1)P<0.01；与模型组比较：2)P<0.01

注：A．正常组：肝小叶结构正常，肝索排列整齐，肝细胞为多边形,细胞边界清晰，细胞核明显,未见肝细胞变性、炎性浸润及肝脏组织坏死；B.模型组：肝组织损伤严重，大部分肝小叶结构破坏严重，肝索排列紊乱，肝细胞广泛水肿，黑箭头所示处肝细胞胞质肿胀明显，呈气球样变及空泡变性，且伴有炎症细胞浸润;C．西利宾胺组：肝小叶结构正常，明显改善肝细胞气球样变及空泡变性；D.GB低剂量组：细胞呈放射状排列,散在少量气球样变及空泡；E.GB中剂量组：细胞呈放射状排列，细胞核位置、形态正常，细胞肿胀减轻；F.GB高剂量组：肝索排列整齐，明显改善肝细胞气球样变和空泡变性图1 复方片仔癀肝宝对病理组织学的影响(HE染色 20×)

2.3 复方片仔癀肝宝对病理组织学的影响

图1显示，复方片仔癀肝宝对病理组织学的影响。

2.4 复方片仔癀肝宝对肝组织中IL-6、IL-10、miR-155mRNA表达的影响

表3显示，与正常组比较，模型组IL-6、miR-155的表达显著升高(P<0.01)，IL-10的表达降低(P<0.05)。与模型组比较，复方片仔簧肝宝各剂量组和西利宾胺组IL-6、miR-155的表达显著降低(P<0.01)，IL-10的表达显著升高(P<0.01)，结果表明复方片仔癀肝宝对miR-155、IL-6、IL-10表达有显著调控作用。

表3 复方片仔癀肝宝对肝组织中IL-6、IL-10、miR-155mRNA表达的影响

注：与正常组比较：1)P<0.01，2)P<0.05，3)与模型组比较：P<0.01

3 讨论

肝损伤的主要原因包括暴力性肝损伤、病理性肝损伤、化学性肝损伤等。大多数肝损伤的病理进程都伴随炎症反应的发生，通常认为炎症反应是引起肝损伤和肝病慢性化至关重要的因素。在炎症发生过程中，肝脏的固有免疫细胞被激活，释放出大量的促炎因子白细胞介素-1β(IL-1β)、IL-6等，炎症因子之间互相促进产生炎症级联反应，进而导致炎症反应失控，进一步加重肝损伤。大多数肝损伤的过程中，都存在IL-6升高、IL-10降低[7-9]，这说明炎症因子和肝损伤密切相关，通过调控炎症因子可以达到控制和治疗肝损伤的目的。四氯化碳(CCl4)是经典、广泛应用的急性肝损伤模型，该模型在实验早期即可见明显的肝细胞损伤和炎症反应。CCl4进入机体后，使得ALT、AST、炎症介质等异常增高，其中ALT和AST是诊断肝胆系统疾病中应用最广泛的酶，是判断肝细胞受损害程度的敏感指标[10]。

MicroRNAs(miRNAs)是指一大类广泛存在于真核生物中约19～22个核苷酸所组成的小分子非编码RNA。其作用通过与靶mRNA的3'端非翻译区(untranslated region,UTR)结合抑制或降解其表达，从而发挥其生物学功能。miR-155基因是一个典型的多功能基因，被认为是新兴的炎症递质，已被报道参与多种生理与病理过程，如炎症反应、肿瘤的发生发展等，在调节先天免疫和适应性免疫及维持系统稳定方面发挥着重要作用。研究表明，多种肝脏疾病及肝损伤过程中都存在miR-155的升高[11-13]，miR-155可作为肝脏损伤的生物标记物，并且miR-155能抑制巨噬细胞向M2型分化，而使炎症反应增强[14-15]；miR-155能促进IL-6表达的同时，通过正反馈机制促进自身表达来发挥促炎作用[16]；miR-155表达的急性下调可减弱炎症反应和纤维化反应，miR-155拮抗剂可引起抗炎因子IL-10表达增加[17]，因此miR-155与肝损伤密切相关。

课题组前期研究表明，复方片仔癀肝宝能减轻肝脏细胞坏死、炎症细胞浸润等病理组织学病变，对肝组织脂肪变性、肝内脂类聚集也有明显的改善作用；降低血清TNF-α、IL-1β、IL-8等炎症因子的含量及活性达到保护急性、慢性肝损伤的作用[3-6]。本实验结果表明，复方片仔癀肝宝通过降低miR-155的表达，激活免疫系统，促进巨噬细胞向M2型分化，降低炎症级联反应和IL-6表达，防止中性粒细胞向肝细胞浸润，减轻肝脏损伤。IL-10是一种强效的抗炎性细胞因子，国内外学者已证实IL-10在肝损伤过程中发挥着重要保护作用，是一个极其关键的肝脏保护性细胞因子[18-19]。复方片仔癀肝宝通过升高IL-10的表达，减少肝组织局部中性粒细胞的浸润、活化，降低中性粒细胞与肝窦内皮细胞的黏附，以减轻肝细胞的损伤；同时还可以降低局部炎性细胞因子的活性，负向调节细胞因子的表达，加强对肝细胞的保护。

综上所述，复方片仔癀肝宝能通过调控miR-155及IL-6和IL-10表达，减轻肝损伤的炎症反应，是其防治肝损伤的机制之一。