梓醇配伍大黄素对EAE小鼠大脑内NRG1的影响❋

康越之，杨 涛，程翠翠，王 蕾，樊永平△

(1.首都医科大学附属北京天坛医院中医科，北京 100050；2.首都医科大学附属北京天坛医院中医脑病研究所，北京 100050；3.北京中医药大学附属东直门医院，北京 100700； 4.首都医科大学中医药学院，北京 100069)

图3 小鼠脑组织透射电镜结果

多发性硬化(multiple sclerosis,MS)作为一种免疫介导的中枢神经系统(central nervous system,CNS)炎性神经退行性病变，髓鞘损伤是其基本病理改变，髓鞘再生是多发性硬化的重要修复方式[1-2]。目前MS西医治疗以激素冲击、免疫抑制治疗为主[3]，由于副作用或价格因素，限制了其在MS治疗中的应用。研究证明，中医药可以改善MS患者中医症状评分、EDSS评分，减少复发率，缓解患者的炎性进程，调节免疫功能[4]。基于MS治疗创立的补肾益髓胶囊(由熟地、酒大黄、炙水蛭、大贝母等药物组成)，已获北京市药监局医院制剂批号(批号临10003)。前期临床及实验研究证实，其治疗MS/实验性自身性免疫性脑脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE)有效[5-8]。

补泻兼施作为补肾益髓胶囊的根本立法，其在临床急性期及缓解期均具有显著疗效。方中梓醇与大黄素分别是补药与泻药的代表药物地黄和大黄的重要有效成分。前期研究发现，补肾益髓胶囊及梓醇可以有效减轻CNS髓鞘脱失程度，还可明显促进小鼠脑和脊髓中少突胶质细胞前体细胞的增殖[8-9]。本研究基于补泻单体相配伍(地黄有效成分-梓醇，大黄有效成分-大黄素)，利用蛋白质印迹法(Western Blot，WB)、实时荧光定量反转录聚合酶链式反应(real-time reverse transcription-polymerase chain reaction，realtime rt-PCR)等方法检测梓醇配伍大黄素在EAE小鼠大脑内对神经调节蛋白-1(neuregulin-1,NRG-1)表达的影响，探讨梓醇、大黄素联用对于髓鞘损伤修复的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF级C57BL/6j雌鼠80只，6～8周龄，购自北京维通利华公司实验动物中心(合格证号SCXK2012-0001)，饲养于首都医科大学实验动物中心(伦理批件AEEI-2014-018)。

1.2 药品及试剂

梓醇(货号2415-24-9，纯度>95%)、大黄素(货号518-82-1，纯度>95%)购自中国食品药品检定研究院；醋酸泼尼松(Prednisone Acetate，PA)购自天津太平洋制药有限公司(批号160337)；MOG35-55(纯度>95%)由北京康为世纪生物科技有限公司合成；完全弗氏佐剂(complete Freund’s adjuvant，CFA)、(货号F5882)、百日咳毒素(pertussis toxin，PTx)、(货号P7209)、灭活结合分枝杆菌(mycobacterium tuberculosis，TB)(货号231145)均购自Sigma公司；NRG1单克隆抗体(货号NB53104)购自美国Abcam公司。

1.3 EAE模型制备

将C57BL/6j小鼠按随机数字表法分为正常组、模型组、激素组、配伍组(EAE+C+E)每组各20只。于背部脊柱旁4点注射抗原乳剂，其由250μg MOG35-55、0.8 mg TB、100 μl CFA、100 μl生理盐水配制而成，免疫当天(第0天)及48 h(第2天)后分别腹腔注射PTx 500 ng/只，诱导产生EAE。

1.4 动物给药及处理方法

从免疫当天开始腹腔注射给药，时间为8∶30～10∶30 am，配伍组的梓醇和大黄素分别给予40 mg/kg和1 mg/kg治疗，激素组在外观行为改变后给予PA 6 mg/kg治疗，直至40 d结束。正常组及模型组生理盐水代替。

1.5 动物行为学观察

自免疫当天开始评价小鼠神经功能。应用Kono5分法(0分：不发病；1分：尾巴乏力脱垂行走；2分：后肢乏力或单侧后肢拖曳行走；3分为严重后肢麻痹或两侧后肢拖曳行走；4分为四肢麻痹；5分为濒临死亡或死亡)。

1.6 取材及观察

在发病高峰期(第18天)及发病缓解期(第40天)取小鼠大脑组织，每组4只多聚甲醛灌注内固定。常规石蜡包埋切片，HE染色。每组4只新鲜取材后-80 ℃保存(40 d模型组死亡1只，共3只)。

1.7 透射电子显微镜观察轴突髓鞘

取出标本，PBS液冲洗3次后1%锇酸固定，酒精脱水，丙酮处理20 min，用包埋剂与丙酮浸透处理后再用纯包埋剂包埋，70 ℃加热过夜，即得包埋好的样品。超薄切片机切片然后染色、镀膜，透射电子显微镜(transmission electron microscope，TEM)观察小鼠大脑组织髓鞘脱散、轴突改变情况。

1.8 realtime rt-PCR方法检测NRG1基因水平

NRG1 mRNA水平检测：采用realtime rt-PCR法检测mRNA水平。标本经处理提取组织总RNA，进行反转录及实时荧光定量PCR反应，以GAPDH为内参照，采用2-△△CT法比较各组NRG1在mRNA层面表达变化。NRG1中mRNA的引物序列为：上游引物：GACCCAGGAGTATGAGCCAAT，下游引物：TTGCTGTCCATTTCCAACCTAT，北京Invitrogen公司合成上述引物。

1.9 westernblot方法检测NRG1蛋白水平

取50 mg组织使用总蛋白提取试剂盒提取蛋白质，经BCA蛋白浓度测定试剂盒测定后制备蛋白样品，12%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离NRG1，电转至PVDF膜，5%脱脂奶粉封闭后加兔抗鼠NRG1单克隆抗体(1∶600)，GAPDH(1∶600)，4 ℃过夜洗膜，二抗山羊抗小鼠IgG(H+L)(1∶10000)室温孵育1 h，洗膜加入DAB显色1 min，暗室曝光显影，凝胶成像分析系统摄像分析扫描，以GAPDH作为内参进行半定量分析。

1.10 统计学方法

注：Normal：正常组，EAE：模型组，EAE+PA：激素组，EAE+C+E：配伍组(*P<0.05，**P<0.01)图1 小鼠神经功能评分比较

2 结果

2.1 神经功能评分变化

图1显示，各实验组小鼠自造模第8天开始陆续起病，模型组小鼠于第15天神经功能评分达到最高2.5分。自第16天至39天，激素组小鼠神经功能评分较模型组显著降低(P<0.05或P<0.01)，配伍组在免疫后第21天、27天至39天与模型组比较评分明显降低，差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。

2.2 各组中大脑组织的病理学改变

图2显示，模型组及各治疗组在高峰期均有大量炎症细胞浸润，形成袖套样改变，缓解期出现部分神经细胞核固缩。各干预组经治疗后较模型组明显减轻。

2.3 TEM

图3TEM显示，正常组大脑内髓鞘排列整齐紧密，薄厚均匀一致，结构清晰(A1、A2)。急性期模型组小鼠髓鞘环形层状结构松散变形，部分髓鞘断裂、崩解、脱失及融合，髓鞘及轴突板层分离，结构紊乱(B1)。缓解期可见髓鞘再生，表现为轴突粗而髓鞘较薄较短(B2)。各治疗组髓鞘环形层状结构松散变形程度较模型组减轻，可见新生的少突胶质细胞(C1-2、D1-2)。

注：A1-D1为第18天小鼠，A2-D2为第40天小鼠。Normal：正常组；EAE：模型组；EAE+PA：激素组；EAE+C+E：配伍组(标尺：2.0 μm)

注：Normal：正常组；EAE：模型组；EAE+PA：激素组；EAE+C+E：配伍组(标尺：2.0 μm)图4 第18天及第40天小鼠各组NRG1蛋白表达量比较

2.4 NRG1的蛋白及mRNA表达量发病高峰期(第18天)配伍组NRG1蛋白表达较之模型组明显提高，差异有统计学意义(P<0.05)。发病缓解期(第40天)，激素组及配伍组NRG1蛋白表达较正常组、模型组明显提高，差异有统计学意义(P<0.05)，其余比较差异无统计学意义(P>0.05)。

图4表1显示，发病高峰期(第18天)配伍组NRG1 mRNA表达较之模型组明显提高，差异有统计学意义(P<0.05)。发病缓解期(第40天)，激素组及配伍组NRG1 mRNA表达较正常组、模型组明显提高，差异有统计学意义(P<0.05)，其余比较差异无统计学意义(P>0.05)。

表1 第18天及第40天小鼠各组NRG1蛋白及mRNA表达分析比较

注：与正常组比较:*P<0.05；与模型组比较:#P<0.05

3 讨论

MS属于中医“痿证”范畴，而肝肾阴虚和痰瘀的病理机制在多发性硬化患者中具有广泛的代表性。前期研究证实，补肾化痰活血法/补肾益髓胶囊治疗MS/EAE的过程中具有良好的疗效，可以明显缓解MS患者中医症状评分、EDSS评分，调节患者外周血的免疫；减轻EAE神经功能缺损，缓解髓鞘及轴突的损伤，提高EAE血清TGF-β水平，下调IFN-γ、MMP-9水平，改善CD4+/CD8+比值[10]，对EAE模型具有显著的神经保护和免疫调节功能。

前期研究发现，作为补肾药物地黄的重要活性单体-梓醇可以明显缓解EAE小鼠发病，减轻神经功能缺损，可以通过增加Olig1/2基因及蛋白的表达，促进少突胶质细胞前体细胞(oligodendrocyte precursor cell,OPC)增殖及分化[11]。研究证实，大黄素具有脑保护作用，可以通过影响Na+-K+AT酶等离子通道，促进细胞外水平衡，减轻脑水肿。同时，大黄素可以作用于L型钙离子通道，抑制炎症作用及纤维化作用，调节血脂异常糖尿病大鼠[12]。本实验结果显示，梓醇配伍大黄素可延长EAE小鼠外观行为改变潜伏期，减少外观行为改变率、降低死亡率，并可改善EAE小鼠外观行为改变后尾部及肢体瘫痪、行走不便等神经症状，降低EAE小鼠神经功能评分。本实验中H&E染色结果显示，在模型组中可见大量炎性细胞浸润，而各治疗组均可不同程度的缓解，说明梓醇配伍大黄素能减轻小鼠炎症反应，从而缓解由EAE带来的炎症损伤。透射电镜下见模型组髓鞘环形层状结构松散变形、崩解、脱失及融合，而配伍组髓鞘环形结构松散变形程度较模型组减轻，梓醇配伍大黄素对髓鞘具有一定的保护作用。

realtime rt-PCR及WB结果提示，配伍组可明显提高NRG1基因及蛋白层面的表达，NRG-1作为含有表皮样生长因子(epidermal growth factor,EGF)样结构域的细胞黏附分子，对髓鞘的再生具有重要作用[13]。其作用机制主要有，一是使轴突表面trkB受体经脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)激活，引起I或II型NRG-1的释放，作用于神经胶质细胞前体细胞，促使神经胶质前体细胞向神经胶质细胞发育。同时NRG-1正反馈于脑源性神经营养因子，促进其释放，对少突胶质细胞形成的微环境具有正向调节作用；二是NRG1可以直接作用于少突胶质细胞，增强和维持少突胶质细胞生长，抑制神经胶质细胞的有丝分裂并诱导少突胶质细胞分化[14]；三是NRG-1作为少突胶质细胞的有效促分裂源和存活因子，促进OPC的增殖和存活[15]。本研究证实，梓醇配伍大黄素可以促进NRG1在基因及蛋白层面的表达，而NRG1具有上述促髓鞘再生的功能，从侧面说明两者配伍能够改善少突胶质细胞再生的微环境，减轻EAE神经的损伤促进修复。

综上所述，梓醇配伍大黄素可以减轻EAE小鼠大脑内的炎性损伤，调节中枢神经系统内的微环境，促进脑内NRG1的基因及蛋白表达，进而对髓鞘的再生具有一定的促进作用。