SPE-HPLC法测定雷公藤半成品及制剂中四种成分的含量

肖安菊，龚达林，刘三波，余 浩，喻 昕

（1.湖北理工学院医学院，湖北 黄石 435003；2.华润三九（黄石）药业有限公司，湖北 黄石 435004）

雷公藤片、雷公藤多苷片为卫矛科木质藤本植物雷公藤（Tripterygium wilfordiiHook.f.）的根或根的去皮部位经醋酸乙酯提取后制成的片剂。原药品标准采用中性氧化铝柱纯化后［1］，采用HPLC法测定雷公藤片中雷公藤甲素的含量。大多数有关雷公藤药材或制剂中主要成分含量测定也较多采用中性氧化铝柱或硅胶柱纯化方法［2-4］。为有效地控制雷公藤半成品、制剂的质量，建立了SPE-HPLC法同时测定雷公藤片中雷公藤甲素、雷公藤红素、去甲泽拉木醛和雷公藤内酯甲的含量，经检测其分离较好、检测灵敏度高，可作为雷公藤半成品、制剂的质量控制方法。

1 材料与方法

1.1 药品

雷公藤半成品（干浸膏、三批）、雷公藤片（批号18080022、19010012、1910001Z）均由华润三九（黄石）药业有限公司提供；雷公藤多苷片购自浙江德恩得制药有限公司（批号1901114B、1903126B、1903127B），江苏美通制药有限公司（批号190202、171201、190403），上海复旦复华药业有限公司（批号160703、180803、190102）。

1.2 试剂

甲醇（HPLC级）、乙腈（HPLC级）、磷酸（HPLC级），德国Fisher公司；三乙胺（HPLC级），德国默克公司；雷公藤甲素（111567-201404，ID：H6RJ-8PRY）、雷公藤红素（111946-201501，ID：YD5C-3WSR），中国食品药品检验研究院；去甲泽拉木醛（CAS：107316-88-1，Lot：AF8121402）、雷公藤内酯甲（CAS：84104-71-2，Lot：AF8010505）标准品，成都埃法生物科技有限公司；甲醇（分析纯），上海展云化工有限公司。

1.3 仪器

UltiMate3000型高效液相色谱仪（包括四元泵、全自动进样仪、DAD检测器，美国Thermo Scientific公司），NAI-FXCQY-24型固相萃取仪（上海那艾精密仪器有限公司），BRP型固相萃取柱（月旭科技（上海）股份有限公司），SB-25-12DT型超声波清洗机（宁波新芝生物科技股份有限公司），RE-3000A型旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂），FA2204C型万分之一电子天平（上海越平科学仪器制造有限公司），MS205DU型十万分之一电子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）。

1.4 方法

1.4.1 色谱条件 色谱柱Kromecil C18柱，柱温30℃，流速1 mL/min，检测波长218、410、210 nm，流动相见表1。

表1 雷公藤半成品、制剂使用的流动相

1.4.2 供试品溶液的制备

1）雷公藤半成品供试液的制备。精密称取干浸膏0.05 g，加甲醇8 mL，30℃超声20 min使溶解，加100μL三乙胺，加甲醇溶液定容。过BRP柱［5］（预先用3 mL甲醇溶液和3 mL水活化），用10 mL乙酸乙酯∶甲醇混合液（10∶5）洗脱，洗脱液40℃旋转蒸发至干燥，甲醇溶解，于10 mL容量瓶中定容，即得供试品溶液。

2）雷公藤制剂供试液的制备。取雷公藤制剂20粒，精密称重，研磨成细粉，取0.5 g，精密称定，滤纸包裹，置于具塞广口瓶中，加30 mL甲醇溶液，50 Hz超声30 min，重复3次，合并提取液，于80℃水浴蒸干，残渣加甲醇溶解，并入10 mL容量瓶中，加100μL三乙胺，后同雷公藤半成品供试液的制备步骤，即得供试品溶液。

2 结果与分析

2.1 线性关系结果

分别取适量4种标准品，置于4个10 mL容量瓶中，加入甲醇溶液分别制成浓度为0.099 0 mg/mL雷公藤甲素、0.995 0 mg/mL雷公藤红素、0.214 0 mg/mL去甲泽拉木醛、0.158 0 mg/mL内酯甲的单标贮备液。分别取各单标贮备液适量，梯度浓度稀释进样检测，回归方程和线性范围如表2。对照品及样品的色谱图见图1。

图1 4种成分对照品图谱和样品图谱

表2 4种成分的标准曲线方程及线性范围

2.2 精密度试验结果

精密称定雷公藤多苷片粉末0.5 g进行色谱检测，连续进样5次。结果表明，雷公藤甲素RSD为2.68%、去甲泽拉木醛RSD为1.55%、雷公藤红素RSD为1.94%、雷公藤内酯甲RSD为3.21%。

2.3 稳定性试验结果

于0、4、8、24、48 h进样测定5次。结果表明，雷公藤甲素RSD为5.89%、去甲泽拉木醛RSD为4.36%、雷公藤红素RSD为2.14%、雷公藤内酯甲RSD为3.27%。

2.4 加样回收试验结果

精密称定6份雷公藤多苷片粉末各0.5 g，按照样品中雷公藤甲素含量的80%、100%、120%加入4种成分的混合标准溶液（含雷公藤甲素0.100 8 mg/mL、雷公藤红素0.194 2 mg/mL、去甲泽拉木醛0.195 2 mg/mL、雷公藤内酯甲0.051 9 mg/mL）进样检测，结果见表3。

表3 加样回收试验结果

2.5 样品含量测定结果

2.5.1 雷公藤半成品含量测定 精密称定3份雷公藤干浸膏各0.05 g，进样检测，结果见表4。

表4 雷公藤浸膏中4种成分含量测定结果（单位：mg/g）

2.5.2 雷公藤制剂含量测定 分别称取3份雷公藤片、雷公藤多苷片各批号样品，进样检测，结果见表5。

表5 雷公藤制剂中4种成分含量测定结果 （单位：mg/g）

3 小结与讨论

雷公藤片、雷公藤多苷片使用药材部位不同（分别是雷公藤根、去皮根），4种成分的含量差异较大，即使是同种产品，不同厂家的产品4种成分之间也有差异。除去甲泽拉木醛毒性相对较小外［6，7］，其他3种成分都有较强的毒性［8，9］，制剂中仅控制雷公藤甲素的含量，不足以有效控制制剂的不良反应。本研究利用固相萃取纯化技术代替了传统手工纯化，重现性更好。省时省力，可作为雷公藤半成品、制剂的质量控制方法。

致谢：特别感谢浙江德恩得制药有限公司销售经理为本研究提供雷公藤多苷片。