浅低温对小鼠前脑缺血再灌注海马区神经凋亡以及BNIP3表达的影响

汤莹莹 潘 峰 贾俊可

浙江大学医学院附属妇产科医院麻醉科，浙江 杭州 310006

脑是人体最重要的器官之一，一旦缺血后脑血流量骤降，易造成脑组织缺氧，引发相关病理生理级联反应，损伤脑细胞[1-4]。及时迅速的治疗措施可以有效缓解脑细胞不可逆性损伤。近年来缺血期低温治疗已被证明具有抑制缺血后过度灌注和减轻神经损伤的作用[5-7]，但具体分子机制尚未完全阐明。腺病毒E1B-19K相互作用蛋白3(BNIP3)是一种Bcl-2家族促凋亡线粒体蛋白，参与细胞凋亡、自噬及线粒体清除过程[8]。已有研究报道，在脑缺血损伤中BNIP3过度激活[9-10]。因此，本研究拟构建小鼠脑缺血再灌注损伤模型，探讨浅低温对小鼠脑缺血再灌注时海马组织神经元凋亡以及BNIP3表达的影响，进一步阐明其脑保护作用的机制。

1 材料与方法

1．1实验动物选取54只健康雄性C57BL/6小鼠，8～12周龄，体质量17～27g，由苏州工业园区爱尔麦特科技有限公司提供[许可编号：SCXK(苏)20140007]。所有小鼠养殖在干净笼子里，通风换气良好，室内温度20～25 ℃，湿度50%～60%。3组小鼠年龄、体质量差异均无统计学意义(P>0.05)。

1．2动物脑缺血模型的制备根据C57BL/6小鼠脑供血的解剖学基础，采用线栓-两血管阻断法建立前脑缺血再灌注实验模型[11-12]：各组小鼠术前禁食8 h以上，饮水自由，4%七氟烷进行麻醉，小鼠表现为四肢肌力下降，不能行走，仰卧后不能翻身，对注射器针尖刺激无体动，即表明麻醉成功。然后将小鼠仰卧，四肢及头部系线固定垫于有发热毯的小鼠固定板上，用啮齿类动物直肠体温计监测小鼠体温并维持在(37±0.3)℃。颈部正中切口2～3 cm，在解剖显微镜下分离出两侧颈总动脉并穿线备用，头顶部插入针状电极，接脑电图仪监测脑电图用。小动脉夹夹闭双侧颈总动脉后开始计时，夹闭15 min后松开动脉夹，恢复血供，在阻断双侧颈总动脉血流后，出现心跳加快，呼吸幅度加深，频率先加快后减慢，脑电抑制，频率降低，波幅变低平等表现的小鼠，作为缺血成功样本入选。S组只暴露双侧颈总动脉并置线不夹闭。H组于松开动脉夹即刻向小鼠全身喷洒酒精行体表降温，本研究参照文献[4]选择浅低温32～34 ℃，即维持直肠温32～34 ℃ 4 h。整个模型制备过程中注意保温，I/R和S组维持直肠温(37±0.3)℃。

1．3标本制备制备于再灌注72 h时随机取12只小鼠，其中6只麻醉后，开胸于心尖处依次灌注生理盐水和4%多聚甲醛。在视交叉后1～4 mm之间切除中间脑组织。固定洗涤，常规梯度酒精脱水，二甲苯透明后石蜡包埋。病理室切片机上于海马齿状回层面连续冠状切片，4 ℃保存备用。其余6只小鼠麻醉后迅速冰上断头取脑，分离海马与皮质组织，置于-80 ℃冰箱保存。

1．4HE染色海马组织锥体细胞每只小鼠取4张连续石蜡切片进行常规脱蜡水化，HE染色，200倍光镜下确定海马区域，在高倍镜下(400倍)观察海马CA1区神经锥体组织的细胞形态结构。

1．5TUNEL凋亡细胞的计数石蜡切片脱蜡水化至水，将石蜡切片放入封闭液中室温处理10～15 min。PBS洗涤3次，5 min/次；按照TUNEL试剂盒(Roche公司，瑞士)说明书操作，DAB 显色，显微镜下观察，细胞核中有棕黄色颗粒者即考虑为TUNEL阳性细胞。在高倍镜下(400倍)下每张切片随机选取海马CA1区不重叠的4个视野，统计TUNEL阳性细胞数，以个/高倍镜视野表示。

1．6Nissl染色海马神经元细胞每只小鼠取4张连续石蜡切片常规脱蜡至水，按Nissl染色液试剂说明书，采用亚甲蓝染色法，200倍光镜下确定海马区域，在高倍镜下(400倍)观察海马CA1区神经元组织的细胞形态结构。

1．7学习记忆障碍试验于术后第8天选取剩余6只小鼠，测试前连续3 d将小鼠置于一个 25 cm×35 cm×40 cm不透明箱子中适应环境10 min，为熟悉期阶段；第4天将2个相同体积、相同颜色的红色物体A和B放入箱子中，让小鼠探索5 min，然后将小鼠放入原来的笼子。测试物体及测试箱都分别用75%酒精、湿布、干布进行擦拭，消除气味对小鼠探索行为和探索物体时间产生的影响。间隔1 h后，进行识别测试，将其中1个红色物体用绿色物体代替，再次将小鼠放置到此箱子中探索 5 min。此时红色立方体为旧物体，而绿色球形物体为新物体，小鼠鼻子与物体间隔<2 cm即为探索行为，确保记录人员事先未知小鼠分组情况，消除人为偏好误差，记录小鼠对新、旧物体的探索时间，计算分辨差异指数。分辨差异指数=新物体探索时间/(新物体探索时间+旧物体探索时间)×100%。差异指数越大，提示对新物体探索时间越长，说明学习记忆能力越好。

1．8免疫印迹法测定BNIP3的表达免疫印迹法测定海马区BNIP3蛋白的表达。按蛋白抽提试剂盒(碧云天生物技术研究所)说明书提取各组大鼠脑组织蛋白，BCA法测定蛋白样品含量，根据标准曲线计算出样品的蛋白浓度；选用8%聚丙烯酰胺凝胶(碧云天生物技术研究所)电泳分离蛋白，转至PYDF膜(Milllpore公司，美国)，5%脱脂奶粉封闭3 h，加一抗单克隆BNIP3抗体(1∶1 000，Cell Signaling Technology公司，美国)，4 ℃孵育过夜，TBST充分漂洗后加入辣根过氧化物酶IgG二抗孵育2 h，ECL显色成像。Quantity One图像分析软件(Bio Rad公司，美国)分析数据。

2 结果

2．1小鼠行为学观察如表1所示，3组小鼠认知事物试验比较，I/R组和H组小鼠新事物分辨差异指数明显较S组降低(P<0.01)，H组小鼠较I/R组小鼠分辨差异指数升高，差异有统计学意义(P<0.01)。

2．2小鼠海马结构形态学观察如图1所示，S组海马CA1区神经椎体细胞3～4层，排列整齐紧密，细胞核大而圆，核仁清晰，未见明显异型细胞；I/R组海马CA1区神经椎体细胞排列较紊乱,形态不规则,部分锥体细胞体积缩小，核固缩胞浆深染、结构不清; H组海马CA1区神经细胞胞体较I/R组紊乱以及肿胀明显减轻，核固缩情况减轻，细胞形态改变明显改善。

2．3海马神经TUNEL凋亡细胞计数比较如图2所示，胞核呈棕色或黄棕色即为TUNEL染色阳性细胞，即凋亡细胞，I/R组和H组海马CA1区TUNEL阳性神经细胞计数较S组升高(P<0.05)，H组海马CA1区TUNEL阳性神经细胞计数较I/R组降低，差异具有统计学意义(P<0.05)。

2．4海马CA1区神经元形态比较尼氏体(Nissl体)是神经元的重要结构成分，Nissl染色是神经元细胞的特异性染色方法，Nissl体大而数量多，说明神经元合成蛋白质的功能较强；相反在神经元受到损伤时，Nissl体的数量会减少甚至消失。如图3所示，S组小鼠海马CAl区锥体神经元细胞排列整齐紧密，形态完整，尼氏体染色浓密规则。I/R组部分细胞排列紊乱，染色消散不清，部分缺失，染色明显变淡；H组较I/R组海马神经元细胞染色深，细胞排列整齐，细胞形态改变明显改善。

表1 3组小鼠海马神经元凋亡计数、学习记忆评分和BNIP3表达比较

注：与S组比较，aP<0.05，cP<0.01；与I/R组比较，bP<0.05，dP<0.01

图1 3组小鼠海马细胞形态学比较(标尺=50 μm，×400倍镜)Figure 1 Comparison of morphological observation of hippocampal formation in different groups of mice.Scale bars=50 μm，×400 visual field

2．5低温对前脑缺血模型小鼠BNIP3蛋白表达的影响如图4和表1所示，I/R组和H组BNIP3蛋白水平较S组明显上调(P<0.05)；H组BNIP3蛋白水平低于I/R组，差异有统计学意义(P<0.05)。

图2 3组小鼠海马神经细胞TUNEL凋亡细胞计数比较(标尺=50μm，×400倍镜)Figure 2 Comparison of ischemia-induced increased neuronal apoptosis in different groups of mice.Scale bars=50 μm，×400 visual field

图3 3组小鼠海马神经元细胞形态学变化(标尺=50 μm，×400倍镜)Figure 3 Comparison of effects of Hypothermia on histopathological changes in mice following IR injury.Scale bars=50μm，×400 visual field

图4 3组小鼠BNIP3蛋白表达比较Figure 4 Comparison of expression of BNIP3 in hippocampus following ischemia-reperfusion injury

3 讨论

脑缺血再灌注损伤是一个复杂的级联反应，包括自由基损伤、钙超载、炎症反应等，缺血再灌注使神经细胞产生快速的级联反应损伤，缺血细胞损害进一步加重，最终导致神经细胞凋亡与坏死，引起脑功能障碍，如认知障碍、学习记忆障碍等[13-17]。

一直以来，人们对于脑缺血再灌注损伤发病机制的研究一直使用动物模型进行研究[18-20]。C57BL6小鼠大脑动脉环先天不发达，后交通支发育不完善，因此对结扎双侧颈总动脉造成的短暂性脑缺血较其他种族小鼠敏感，广泛用于制备脑缺血再灌注损伤模型，本研究参照文献[11]的方法制备C57BL/6小鼠前脑缺血再灌注损伤模型，结果显示，脑缺血再灌注组小鼠海马区CA1区神经细胞发生较为明显形态学损伤，神经细胞凋亡计数升高，表明小鼠脑缺血再灌注损伤模型制备成功。海马对脑缺血尤其敏感，最易发生细胞缺血和坏死，且海马结构的损伤与学习记忆障碍密切相关[21-25]，因此本研究参照文献[26]采用新事物识别试验比较3组小鼠的学习记忆能力，间接评估小鼠脑缺血再灌注后海马区受损程度及预后。结果表明，术后8 d I/R组和H组小鼠分辨差异指数明显下降，提示脑缺血损伤后小鼠海马区受损明显，导致短期认知功能减退。

BNIP3又称Bcl2/腺病毒E1B-19K相互作用蛋白3，是Bcl-2蛋白超家族中亚家族的促凋亡成员之一。近年来大量研究发现，缺血性脑损害是诱导BNIP3表达上调最明显的刺激之一，神经细胞缺血缺氧后很多基因被诱导表达，这些基因编码的蛋白产物又经过多种途径介入对凋亡的调控。BNIP3是目前发现唯一通过凋亡、自噬及坏死等多种途径引起缺血性神经细胞死亡的因子，主要机制包括介导Caspase非依赖性线粒体凋亡途径，线粒体膜通透性转换孔开放、膜电位丧失等导致线粒体功能的丧失[27-29]，引起染色质的浓缩、DNA断裂，从而诱发细胞调亡；游离并激活Bax或Bak分子，结合形成四聚体通道，促使线粒体释放细胞色素C、AFP等活化Caspase-9依赖性的细胞凋亡通路等。本研究同样发现，在小鼠前脑缺血模型中，与对照组相比，再灌注损伤72 h时缺血组海马组织BNIP3蛋白的表达明显升高，海马神经元形态学改变，凋亡细胞明显增加，脑功能障碍加重，提示脑缺血再灌注促进BNIP3表达，进而促进细胞凋亡；另外，WANG 等[30]研究表明，抑制BNIP3表达保护了神经前体细胞的凋亡，阻断了AIF核转录信号通路。

低温疗法目前越来越多地应用于缺血性脑卒中、脑出血、脑外伤等的治疗，是一种较为可靠的脑保护措施[31-32]。低温治疗操作简单、安全性高、并发症少[33]，临床上可降低患者的经济负担，提高缺血性脑疾病的治疗效果，值得高度重视。再灌注损伤中低温保护机制依然是近几年研究热点[34-37]，近年来研究发现其脑保护机制与抑制细胞凋亡有密切的关系，而低温对脑缺血组织中BNIP3表达的影响未见报道。本研究表明，与缺血组相比，低温组小鼠BNIP3蛋白水平明显降低，且低温组小鼠海马组织细胞形态学损伤明显好转，神经细胞凋亡率降低，学习记忆能力提高，提示低温减轻了脑缺血再灌注损伤，改善了脑功能。

脑缺血低温治疗后，可以减轻缺血造成的海马CAl区神经元损伤，缓解神经细胞凋亡，部分恢复小鼠的学习记忆能力，可能与下调BNIP3表达有关，但低温抑制BNIP3促凋亡信号通路的具体分子机制有待进一步研究。