吡柔比星联合羟喜树碱灌注化疗对晚期膀胱癌细胞恶性生物学行为的影响

吴建军 罗 源 董 磊

(湖北省武汉市红十字会医院1 泌尿外科，2 肿瘤科，武汉市 430050，电子邮箱：zengjg2@163.com)

膀胱癌是泌尿系统常见的恶性肿瘤，男性发病率较高，以无痛性肉眼血尿为主要临床表现，部分患者临床表现不明显，诊断时已为晚期[1-2]。晚期膀胱癌的治疗以局部肿瘤切除为主，术后辅以膀胱灌注化疗防止复发，但不同灌注化疗方案可带来不同治疗结局[3]。羟喜树碱、吡柔比星是目前临床应用最多的膀胱癌灌注化疗药物。本研究比较吡柔比星单独灌注化疗与吡柔比星联合羟喜树碱灌注化疗对晚期膀胱癌细胞恶性生物学行为的影响，为临床治疗提供参考，现报告如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 回顾性分析2014年1月至2017年11月在本院治疗的77例晚期膀胱癌患者临床资料，患者均采用膀胱灌注化疗。纳入标准：(1)符合原发性膀胱癌诊断标准[4]，肿瘤分期为晚期；(2)均为首次确诊；(3)可耐受化疗毒副作用；(4)预计生存时间≥3月；(5)患者及家属签署知情同意书。排除标准：(1)合并其他组织脏器原发性恶性肿瘤者；(2)合并全身感染性疾病者；(3)出现化疗药物严重毒副反应并导致治疗中断者；(4)治疗期间死亡、数据缺失者。根据膀胱灌注化疗方案将患者分为吡柔比星组40例与联合治疗组37例，其中吡柔比星组男23例、女17例，年龄48～79(58.72±8.82)岁，病程(1.94±0.32)年，手术时间(92.93±11.84)min；联合治疗组中男20例、女17例，年龄45～78(59.23±8.23)岁，病程(2.08±0.36)年，手术时间(95.12±12.18)min。两组患者一般资料比较，差异均无统计学意义(均P>0.05)，具有可比性。

1.2 治疗方法 两组患者均采用膀胱部分切除术治疗，术后开始规律膀胱灌注化疗。吡柔比星组采用吡柔比星膀胱灌注化疗：吡柔比星(海正辉瑞制药有限公司，国药准字H20045983)30 mg+5%葡萄糖注射液40 mL，膀胱灌注30 min后方可排尿。1次/周，连续灌注化疗8周后改为每月1次，再继续治疗10次，共18次。联合治疗组采用吡柔比星联合羟喜树碱膀胱灌注化疗：吡柔比星30 mg+羟喜树碱(贵州汉方制药有限公司，国药准字H20033960)20 mg+5%葡萄糖注射液40 mL，膀胱灌注30 min后方可排尿。1次/周，连续灌注化疗8周后改为每月1次，再继续治疗10次，共18次。

1.3 膀胱癌细胞恶性生物学行为相关基因表达量检测 两组患者完成所有膀胱灌注化疗后，行膀胱镜检查并在膀胱镜下剪取约1 mm3的病变组织标本，生理盐水冲洗后在液氮内短暂冷冻，取出后在-80℃冰箱保存。采用荧光定量PCR法检测膀胱癌细胞相关增殖基因、侵袭基因及凋亡基因mRNA的相对表达水平。增殖基因包括三磷酸腺苷结合盒转运蛋白E亚族成员1(adenosine triphosphate-binding cassette sub-family E member 1，ABCE1)、核转运蛋白α2(karyopherin alpha 2，KPNA2)、线粒体核糖体蛋白S5(mitochondrial ribosomal protein S5，MRPS5)、yes相关蛋白(yes-associated protein，YAP)、DKK2、人源性长寿保障基因2(homo sapiens longevity assurance homologue 2，LASS2)。侵袭基因包括整合素相关激酶(integrin-linked kinase，ILK)、核因子-κBp65(nuclear factor-κBp65，NF-κBp65)、高迁移率族蛋白B1(high mobility group box 1，HMGB1)、过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferator-activated receptor γ,PPARγ)。凋亡基因包括 Livin、Bad、Survivin、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(cysteinyl aspartate specific proteinase 3，Caspase-3)、BAG-1。PCR试剂盒均购自北京康为世纪公司(批号：CW2601S)，PCR反应后自动生成循环曲线和循环阈值(Ct)，根据公式2-△△Ct计算基因mRNA表达量。

1.4 统计学分析 采用SPSS 23.0软件进行统计学分析。计量资料用(x±s)表示，比较采用t检验。P<0.05为差异统计学有意义。

2 结 果

2.1 两组患者膀胱癌细胞增殖基因相对表达量比较 联合治疗组ABCE1、KPNA2、MRPS5、YAP的mRNA相对表达量均低于吡柔比星组，DKK2、LASS2的mRNA相对表达量均高于吡柔比星组(均P<0.05)。见表1。

表1 两组患者膀胱癌细胞增殖基因相对表达量比较(x±s)

2.2 两组患者膀胱癌细胞侵袭基因相对表达量比较 联合治疗组ILK、NF-κBp65、HMGB1的mRNA相对表达量均低于吡柔比星组，PPARγ的mRNA相对表达量高于吡柔比星组(均P<0.05)。见表2。

表2 两组患者膀胱癌细胞侵袭基因相对表达量比较(x±s)

2.3 两组患者膀胱癌细胞凋亡基因相对表达量比较 联合治疗组Livin、Survivin、BAG-1 的mRNA相对表达量均低于吡柔比星组，Bad、Caspase-3的mRNA相对表达量均高于吡柔比星组(均P<0.05)。见表3。

表3 两组患者膀胱癌细胞凋亡基因相对表达量比较(x±s)

3 讨 论

晚期膀胱癌的治疗以局部肿瘤切除联合膀胱灌注化疗为主，化疗方案的选择可能直接影响患者预后[5]。羟喜树碱及吡柔比星具有降低肿瘤细胞恶性活力的作用，应用于不同恶性肿瘤的治疗中可获得较好的疗效。有学者推荐将吡柔比星与羟喜树碱联合用于晚期膀胱癌患者的膀胱灌注化疗中，以提高疗效[6-7]。

晚期癌症患者的癌细胞增殖旺盛，是肿瘤体积不断扩大及机体肿瘤负荷持续增加的基础，多种增殖相关基因参与其中。ABCE1是参与肿瘤形成及发展的新型调控分子，可阻断抗病毒2-5A/RNase L通路，抑制细胞凋亡并促进其增殖，在多种恶性肿瘤组织中均呈高表达[8-9]。KPNA2是一种相对保守的核转运蛋白，可调节细胞核内多条信号通路的下游分子表达，目前已经在乳腺癌、卵巢癌、食管癌等恶性肿瘤组织中发现其异常高表达，细胞学研究发现沉默KPNA2表达可显著抑制膀胱癌细胞的增殖能力[10-11]。MRPS5可通过线粒体代谢机能障碍途径调控小鼠寿命，与机体衰老、肿瘤发生易感性均相关[12]。YAP属于Hippo信号通路下游转录因子，通过磷酸化修饰作用在多种肿瘤的发生发展中发挥重要作用，目前已经证实其在膀胱尿路上皮癌中表达异常上调，且具体表达量与肿瘤分期、预后密切相关[13-14]。DKK2是调控Wnt信号通路的常见分泌型蛋白，其在结肠癌、肾癌、胃癌等多种恶性肿瘤中呈高度甲基化，扮演抑癌基因的作用[15]。LASS2可抑制多种肿瘤细胞的增殖、侵袭转移，其低表达甚至不表达是恶性肿瘤进展的主要原因[16]。本研究结果显示，联合治疗组ABCE1、KPNA2、MRPS5、YAP mRNA相对表达量均低于吡柔比星组，DKK2、LASS2 mRNA相对表达量均高于吡柔比星组(均P<0.05)，说明吡柔比星联合羟喜树碱灌注化疗更能抑制膀胱癌细胞的增殖能力。

恶性肿瘤细胞的侵袭转移有赖于一系列侵袭相关基因的异常表达，检测其具体表达量也可定量反映癌细胞的侵袭活力。ILK属于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，是细胞与细胞外基质黏附的关键成分，可与整合素β1的亚单位结合并影响多条信号通路的蛋白表达[17]。ILK过表达可经多种途径抑制癌细胞凋亡并促进其增殖、侵袭。NF-κBp65是重要的核转录因子，在许多恶性肿瘤细胞中存在持续激活的NF-κBp65，故特异性抑制其表达也成为治疗恶性肿瘤的新途径[18]。HMGB1是细胞核内的重要结构蛋白，具有协助基因转录、稳定细胞核等作用，同时可促进DNA损伤修复。有学者指出，在肝癌、前列腺癌、胃肠道恶性肿瘤中均存在HMGB1的特异性过表达，且具体表达量与癌细胞的侵袭能力呈正相关[19-20]。PPARγ是一种细胞内转录因子，其激动剂具有明显抗肿瘤作用，恶性肿瘤组织中其异常低表达[21]。本研究结果显示，联合治疗组ILK、NF-κBp65、HMGB1 mRNA相对表达量均低于吡柔比星组，PPARγ mRNA相对表达量高于吡柔比星组(均P<0.05)，说明吡柔比星联合羟喜树碱灌注化疗更能抑制膀胱癌细胞的侵袭能力。

凋亡是一种程序化死亡过程，老化或者损伤细胞的凋亡是维持机体正常新陈代谢过程的重要环节，损伤细胞的凋亡受阻是细胞恶变的起始环节，其本质是促凋亡基因/抗凋亡基因的表达失衡。Livin属于凋亡蛋白抑制因子家族，在多种恶性肿瘤中呈高表达并阻碍癌细胞的正常凋亡、促使其增殖迁移[22]。Bad是一种促凋亡基因，研究证实其在肝内胆管癌中表达缺失，且在多种其他恶性肿瘤中呈异常低表达[23]。Survivin属于抗凋亡基因，生理状态下在成人正常组织中表达量较低，但在肿瘤恶变后可大量表达于肿瘤组织中，参与癌细胞的持续增殖及凋亡抑制[24]。Caspase-3是几乎所有细胞凋亡执行的重要分子，受多种基因调控，其异常低表达是细胞凋亡受阻的直接原因[25]。BAG-1具有增强细胞抗凋亡能力的作用，细胞学研究发现高表达的BAG-1细胞株可有效阻止细胞毒性T细胞诱导的细胞凋亡[26]。本研究结果显示，联合治疗组Livin、Survivin、BAG-1 mRNA相对表达量均低于吡柔比星组，Bad、Caspase-3 mRNA相对表达量均高于吡柔比星组(均P<0.05)，说明吡柔比星联合羟喜树碱灌注化疗更能促进癌细胞的凋亡进程。

综上所述，相比于单用吡柔比星膀胱灌注化疗，采用吡柔比星联合羟喜树碱膀胱灌注法治疗晚期膀胱癌患者能更有效抑制地癌细胞的增殖、侵袭活力，并促进癌细胞凋亡，值得推广应用。