莫西沙星增加哮喘大鼠气道平滑肌细胞Caveolin-1的表达

李慧婷 赵杰 李海泉 施萍 张衍民 杜永亮

徐州医科大学第二附属医院呼吸内科,徐州221006

支气管哮喘(哮喘)患者气道平滑肌细胞(airway smooth muscle cell,ASMC)呈现病理状态,表现为高增殖性、高收缩性及高分泌性[1],是参与哮喘发病的重要细胞。其高分泌性表现为在炎症因子作用下分泌大量炎症因子[如IL-6、IL-8、IL-13及嗜酸粒细胞趋化因子(Eotaxin)]及细胞外基质蛋白等[2],这些炎症介质可导致气道炎症持续及级联放大,反过来作用于ASMC,致其增殖增加及收缩增强,参与哮喘发病。我们前期研究发现莫西沙星可抑制大鼠ASMC 炎症因子IL-8 及Eotaxin的分泌[3],但具体机制尚不清楚。小凹蛋白-1(caveolin-1,Cav-1)在气道炎症中担当着重要角色[4],且哮喘患者Cav-1水平明显下调[5],提示Cav-1对气道炎症具有保护作用。本研究旨在探讨莫西沙星对ASMC的Cav-1蛋白及mRNA 表达的影响,探索莫西沙星对ASMC 抗炎作用发挥的可能机制。

1 材料与方法

1.1 材料 莫西沙星(德国拜耳医药保健股份公司),Cav-1 人抗山羊单克隆抗体(16447-1-AP,美国proteintech公司),二抗山羊抗兔IgG H & L(HRP)(ab6721,英国abcam 公司),胎牛血清(中国上海徕创生物科技有限公司),大鼠[中国,徐州医科大学动物房,动物许可证号：SYXK(苏)2016-0028],荧光定量检测试剂盒(RR420A,中国上海驰勇生物科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 动物饲养及分组 用随机数字表法将40只SD 雄性大鼠随机分为正常组(10 只),哮喘组(30只),适应性饲养一周。

1.2.2 哮喘大鼠模型制备 将30只哮喘组大鼠应用鸡卵蛋白腹腔注射(1 mg)及间断雾化吸入3次(30 min)的方式复制哮喘大鼠模型,正常组大鼠应用同等量生理盐水干预,方法同前[6]。

1.2.3 ASMC 的培养及传代 无菌摘取正常组及哮喘组大鼠气管,贴壁法进行细胞原代培养,以胰酶消化法进行ASMC 传代并自然纯化细胞,实验取5～6代细胞,方法同前[7]。

1.2.4 Western blot检测Cav-1蛋白表达 将培养细胞分为正常组作为空白对照组(A 组),哮喘组分为哮喘对照组(B 组)、莫西沙星干预哮喘组(C组)、地塞米松干预哮喘组(D 组)。A 组用正常血清培养细胞,B、C、D 组用致敏血清培养,方法同前[3]。A、B 组用生理盐水处理细胞,C 组应用莫西沙星(5 mg/L)处理细胞,D 组应用地塞米松处理细胞,培养ASMC 48 h,提取细胞总蛋白,经电泳、转膜后杂交,一抗为Cav-1人抗山羊单克隆抗体,二抗为山羊抗兔IgG,以NBT/BCIP显色。条带灰度用Image J软件分析。实验重复操作3次。

1.2.5 qRT-PCR 定量检 测 Cav-1 m RNA 表达

1.2.5.1 细胞RNA 提取 前期处理细胞方法同上(1.2.3),干预ASMC 48 h后,在细胞液中加入TRIzol试剂,提取细胞RNA。检测RNA 纯度,结果显示OD260/280 比值在1.8～2.0之间,表明无RNA 降解,无蛋白污染。

1.2.5.2 cDNA 的合成 取总RNA 提取物加入随机引物、缓冲液、逆转录酶等,混匀后在42 ℃温浴2 h,94 ℃,5～10 min,待逆转录反应完成之后,将cDNA 保持在-20 ℃冰箱备用。

1.2.5.3 qRT-PCR 反应 目的基因及内参基因的引物设计,先从中查找相应基因的序列,在引物设计软件中设计相应引物,引物序列如下：Caveolin-1,上游5'-GCGACCCTAAACACCTCAAC-3',下游5'-ATGCCGTCAAAACTGTGTGTC-3'；β-actin,上 游 5'-TTGTTACAGGAAGTCCCTTGCC-3',下 游 5'-ATGCTATCACCTCCCCTGTGTG-3'；Cav-1扩增片段为138 bp,β-actin扩增101 bp。将PCR 反应体系置于离心机以4 ℃、5 500 r/min,离心半径6 cm,离心5 min,上机,循环程序：95 ℃,2min；95 ℃,15 s；60 ℃,50 s；40 个循环。

1.2.5.4 数据的分析 首先将实验所有的基因Ct值整理好,之后每一组样本自身的目的基因Ct值减去自身内参基因Ct值,得到的数就是△Ct。换成公式就是：△Ct=Ct(目的基因)-Ct(内参基因)。用本次实验研究样本的△Ct减去对照组样本的△Ct 并同时对结果取相反数,结果就是-△△Ct。最后,对-△△Ct进行2 的幂运算,即2-△△Ct就得出实验组和对照组靶基因的转录倍数。

1.3 统计学分析 采用SPSS 20.0软件包统计分析数据。所有实验数据使用。2组数据之间的比较使用Student-t检验,多组间采用单因素方差分析。

2 结果

2.1 ASMC 形态鉴定 倒置显微镜下,培养的ASMC呈梭形,平行生长,束状排列,密集与稀疏处相互交错呈 “峰谷状”(图1)。

图1 倒置显微镜下的细胞形态学鉴定图 ×400

2.2 ASMC 免疫组织化学法鉴定 免疫细胞化学检测法表明,抗平滑肌-actin抗体呈阳性染色即胞浆内可见大量绿色荧光,证实所培养细胞是ASMC(图2)。

图2 免疫荧光显微镜法示AMSC细胞发绿色荧光 ×400

2.3 莫西沙星对ASMC Cav-1蛋白表达的影响B组[(1.16±0.05)]Cav-1蛋白表达量均较A、C、D 组[Cav-1 蛋白表达量分别为(3.56±0.05)、(2.86±0.11)、(3.01±0.17)]降低,差异有统计学意义(P值均＜0.05)。C组与D 组之间Cav-1 蛋白表达量差异无统计学意义(P＞0.05)。见图3、4。

图3 Western blot检测ASMC Cav-1蛋白电泳图

图4 莫西沙星对ASMC Cav-1蛋白表达的影响

2.4 莫西沙星对ASMC Cav-1 m RNA 表达的影响 qRT-PCR结果显示B 组[(1.00±0.11)]Cav-1 mRNA 表达量均较 A、C、D 组[m RNA 表达量分别为(3.26±0.22)、(2.68±0.11)、(2.93±0.05)]降低,差异有统计学意义(P值均＜0.05),C 组与D 组之间Cav-1蛋白表达量差异无统计学意义(P＞0.05)。见图5。

3 讨论

哮喘患者ASMC 呈现病理状态[1],在哮喘发病中充当着促炎细胞及主要的炎症效应细胞双重角色[8],其量的增加是哮喘患者大气道进行性狭窄的主要原因[9],与重症及难治性哮喘发病密切相关[10]。因此,寻找针对ASMC 发挥抗炎免疫调节作用的药物及作用机制可能将为重症及难治性哮喘的控制及治疗提供新的思路。

图5 莫西沙星对ASMC Cav-1 mRNA 表达的影响

我们已证实莫西沙星可以直接作用于大鼠ASMC,干扰ASMC 增殖[11]、诱导凋亡[7]及抑制炎症因子分泌[3],本实验中莫西沙星可以直接干预大鼠ASMC并影响ASMC形态及数量,这与我们既往结论一致。

莫西沙星可对多种细胞发挥抗炎调节作用[3,12],但其具体作用机制尚不清楚。Cav-1作为支架蛋白构成细胞表面穴样内陷(Caveolae)介导胞吞,其可通过抑制一氧化氮生成[13]及影响ASMC内钙离子浓度在气道炎症中发挥重要作用[14],但莫西沙星对哮喘气道炎症的保护作用是否与Cav-1相关少有研究。

本实验研究发现大鼠ASMC 中存在Cav-1 蛋白及 m RNA 表达。哮喘组 ASMC Cav-1 蛋白及m RNA 表达量均较正常组明显降低,提示Cav-1可能在哮喘性气道炎症中担当保护作用,与既往结论一致[14]。应用莫西沙星或地塞米松干预哮喘组ASMC 后,结果显示 2 组 ASMC Cav-1 蛋 白及m RNA 表达量均较哮喘对照组明显增加,且2组之间差异无统计学意义,提示莫西沙星可增加哮喘大鼠ASMC Cav-1蛋白及m RNA 表达量,但其是否为莫西沙星抑制哮喘性大鼠ASMC 炎症因子IL-8及Eotaxin 分泌的上游机制,尚需进一步研究。另外,关于莫西沙星增加哮喘大鼠ASMC Cav-1蛋白及m RNA 表达量的具体机制仍未可知。

莫西沙星组织渗透性较强,肺组织细胞内浓度较血清中高达数倍甚至数十倍,与静脉给药相比,雾化吸入后气道上皮细胞内浓度并未明显升高[15],主要因为细胞存在药物外排机制。P糖蛋白是介导药物主动外排的主要转运蛋白,对脂质药物最为敏感[16],莫西沙星脂溶性较强,当胞内浓度较高时,可上调P 糖蛋白,启动外排机制,防止胞内药物浓度过高[15]。P 糖蛋白转运功能的发挥需要借助细胞表面Cav-1 支架蛋白的作用[17]。另外,近年来研究发现过表达Cav-1可明显提高食管鳞状细胞癌P糖蛋白m RNA 及蛋白水平,敲减Cav-1将致P糖蛋白表达明显下降,提示Cav-1对P糖蛋白表达具有调控作用[18]。我们推测当莫西沙星以高浓度扩散进入ASMC 胞内时,P 糖蛋白首先感知刺激信号,然后引起Cav-1表达水平上调,Cav-1表达上调后反过来刺激P 糖蛋白表达增加,最后P糖蛋白将胞内浓度过高的莫西沙星转运出细胞,但具体机制尚需更多的研究。

本研究结果揭示莫西沙星可增加哮喘大鼠ASMC Cav-1的表达,其可能与莫西沙星抑制哮喘大鼠气道炎症机制相关。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突