甲泼尼龙预处理对机械通气相关性肺损伤大鼠JNK信号通路的影响

崔秀玲 瞿敏 托景堂

沧州市中心医院麻醉二科061001

机械通气是救治危重症患者及术中呼吸支持的重要手段,同时机械通气还可导致肺损伤或加重原有的肺损伤称为机械通气相关性肺损伤[1]。c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)是丝裂原激活蛋白激酶(mitogen activated protein kinase,MAPK)家族重要成员之一,广泛参与免疫反应、细胞分化和凋亡、胚胎发育等多种生理病理过程。有报道指出,JNK 信号通路参与了机械通气相关性肺损伤的发生[2-3]。甲泼尼龙属中效糖皮质激素是治疗各种炎性疾病的常用药物,具有强大的抗炎及免疫抑制作用,能有效消除肺组织水肿,能减轻呼吸机相关性肺损伤[2]。本研究通过制备大鼠大潮气量机械通气急性肺损伤模型,观察甲泼尼龙预处理对大鼠肺组织炎症、水肿、细胞凋亡的影响,并探讨其机制,为临床用药提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验动物来源、分组及处理 清洁级雄性SD大鼠80只,购至河北省实验动物中心,实验动物合 格 证 号：SCXK(冀)2015-0007,批 号：37001800000321,体质量250～300 g。所有大鼠均按照实验动物管理和使用指南进行饲养和处理,于恒温环境中饲养,自由饮水和进食。实验经沧州市中心医院伦理委员会核实批准。将80只大鼠采用随机数字表法分为对照组(C 组)、机械通气组(V 组)、甲泼尼龙(意大利Pfizer Manufacturing Belgium NV 公司)组(Mp组)、SP600125+甲泼尼龙组(SMp组),各20只。C 组不行机械通气,自主呼吸空气4 h；V 组、Mp组、SMp组大潮气量机械通气4 h,机械通气前30 min,SP600125+甲泼尼龙组(SMp组)给予JNK 抑制剂SP600125(中国深圳晶美公司)30μg/100 g皮下注射；机械通气前20 min,Mp组、SMp组分别静脉输注甲泼尼龙10 mg/kg；V组静脉给予等容量0.9%氯化钠。

1.2 观察指标

1.2.1 氧合指数(oxygenation index,OI) 采集各组大鼠插管即刻及机械通气1、2、4 h 时(T1-4)股动脉血样0.2 ml采用i-STAT1 型血气分析仪(美国雅培公司)行血气分析,记录PaO2并计算OI。OI=PaO2/FiO2。

1.2.2 支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF)中蛋白含量、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、巨噬细胞炎性蛋白-2(macrophage inflammatory protein-2,MIP-2)、肺通透指数(lung permeability index,LPI)及肺湿/干重(wet/dry weight,W/D) T4 时取各组大鼠股动脉血样2 ml 4 ℃下3 000 r/min离心15 min,离心半径7.9 cm,分离血清测定血浆蛋白浓度。取血后按照实验动物伦理学要求经动脉放血处死大鼠,开胸结扎大鼠右侧肺门,采用4 ml生理盐水灌洗左肺3 次,回收BALF,于4 ℃下1 500 r/min离心10 min,离心半径15 cm,取上清液,-80 ℃保存。采用双抗体夹心酶联免疫吸附法(enzyme linkedimmunosorbent assay,ELISA)检测BALF中的TNF-α和MIP-2的浓度。采用考马斯亮蓝法检测BALF 中蛋白含量。LPI=BALF 蛋白浓度/血浆蛋白浓度。取左肺下叶称肺湿重,然后置于75℃干燥箱中48 h烤至恒重后称干重,计算W/D。

1.2.3 髓过氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)与细胞间黏附分子-1(intercellular adhesion molecule-1,ICAM-1) 取出右肺中叶,迅速存于液氮中以备匀浆,按重量体积比1∶19加入缓冲液制备5%组织匀浆,测定肺组织MPO 活性。取肺组织切片,采用免疫组织化学法检测ICAM-1的表达水平。

1.2.4 肺组织细胞凋亡指数(apoptotic index,AI) 采用TUNEL 法光镜下随机选取各组大鼠肺泡区10个高倍视野(×400),观察细胞凋亡情况,计算AI,AI=凋亡阳性细胞数/细胞总数×100%。

1.2.5 肺组织病理学观察及肺泡损伤率(alveolar injury rate,AIR) 取各组大鼠右肺下叶组织左肺下叶约(1.0 cm×1.0 cm×1.0 cm)组织,经甲醛固定、石蜡包埋、切片、HE 染色,光镜下(×200)观察肺组织病理学结果。光镜下连续观察200个肺泡计算AIR,即损伤肺泡计数占总肺泡计数的百分比。

1.2.6 RT-PCR法检测肺组织JNK m RNA 表达 取大鼠右肺上叶组织100 mg,采用TRIzol法提取总 RNA,按照逆转录试剂盒(美国Fermentas Life Science公司)行cDNA 扩增。采用primer 5.0软件设计内参β-actin 及JNK 引物。β-actin(产物片断405 bp)：上游引物序列为5'-ATGGTATTCTTGCCTGAC-3',下游引物序列为 5'-AATGTACGTGGATACTGAG-3'； JNK(产物片断400 bp)：上游引物序列为5'-AATCCTGAGCAAAGCTGAGAAC-3',下游引物系列为 5'-CGTACAAAACCAATCACGAGAA-3'。PCR反应条件：95 ℃、10 min,95 ℃、30 s,55 ℃、30 s,72 ℃、30 s,33个循环后72 ℃、10 min。4 ℃终止反应。采用Imager图像分析仪测定各条带吸光度值,以JNK 吸光度值与β-actin吸光度值之比代表JNK mRNA 的表达水平。

1.2.7 Western blotting 法检测JNK、磷酸化JNK(p-JNK)表达 取各组大鼠右肺上叶组织100 mg,BCA 标准曲线法测定蛋白浓度,取40μg蛋白上样经10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳后转至硝酸纤维膜,室温下用封闭液封闭2 h后加入一抗(美国Santa Cruz公司)兔抗大鼠p-JNK、JNK、β-actin稀释度(1∶500),4 ℃过夜。次日洗膜后加入山羊抗兔二抗(中国北京中杉金桥生物科技有限公司)稀释度(1∶500),室温孵育1.5 h,再次洗膜后置于NBT/BCIP 显色液避光显色,扫描蛋白印记图,采用Reveal型lmager图像分析仪(美国Bio-Rad公司)进行半定量分析,以目的蛋白条带吸光值比内参β-actin条带吸光值来反应目的蛋白表达水平。

1.3 统计学分析 采用SPSS 17.0软件包进行统计分析,计量资料以表示,组间比较采用单因素方差分析,P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠OI比较 SMp组与V 组T3、T4时OI较 T1 时降低(F=12.16,P＜0.05)；V组与SMp 组 T3、T4 时 OI较 C 组降低(F=11.95,P＜0.05)；与V 组比较,Mp组与SMp组T3、T4时OI升高(F=10.86,P＜0.05)。见表1。

表1 各组大鼠各时点OI比较(mm Hg,)

表1 各组大鼠各时点OI比较(mm Hg,)

注：1 mm Hg=0.133 kPa；C 组为对照组；V 组为机械通气组；Mp组为甲泼尼龙组；SMp组为SP600125+甲泼尼龙组；OI为氧合指数；与T1时比较,F =12.16,a P ＜0.05；与C 组比较,F =11.95,b P ＜0.05；与 V 组比较,F =10.86,c P ＜0.05

组别 鼠数 T1 T2 T3 T4 C组 20 585±33 565±25 561±31 553±25 V 组 20 583±32 503±28 251±13ab 213±11ab Mp组 20 581±29 574±33 559±21c 548±15c SMp组 20 586±34 521±26 271±14ab 224±13ab

2.2 各组大鼠 W/D、LPI、AIR、ICAM-1、MPO 比较 与C 组比较,V 组与SMp组肺组织W/D、LPI、AIR、ICAM-1、MPO 升 高(F=4.05、3.78、12.95、4.10、3.14,P值 均 ＜0.05),Mp组上述指标差异无统计学意义(P＞0.05)；与V 组比较,Mp组与SMp组肺组织 W/D、LPI、AIR、ICAM-1、MPO 降低(F=4.05、3.78、12.95、4.10、3.14,P值均＜0.05)；与Mp组比较,SMp 组肺组织 W/D、LPI、AIR、ICAM-1、MPO 升高(F=4.05、3.78、12.95、4.10、3.14,P值均＜0.05),见表2。

2.3 各组大鼠BALF 中总蛋白、TNF-α、MIP-2浓度的比较 与C 组比较,V 组与SMp组BALF中总蛋白、TNF-α、MIP-2 升高(F=19.45、13.68、12.53,P值均＜0.05),Mp组上述指标差异无统计学意义(P＞0.05)；与V 组比较,Mp组与SMp组BALF 中总蛋白、TNF-α、MIP-2浓度降低(F=19.45、13.68、12.53,P值均＜0.05)；与Mp组比较,SMp组BALF 中总蛋白、TNF-α、MIP-2 浓度升高(F=19.45、13.68、12.53,P值均＜0.05),见表3。

2.4 各组大鼠肺组织病理学观察结果 光镜下C组肺组织形态正常,肺泡完整,肺泡腔无渗出及出血,肺间质未见增厚水肿,罕见中性粒细胞。V 组肺泡结构紊乱,肺间质水肿,肺泡间隔增厚,肺泡内出血、水肿、红细胞漏出、炎性细胞浸润。Mp组较V 组病理损伤减轻,肺泡形态正常,肺泡间隔轻微增厚,肺间质轻度水肿,肺泡腔无明显出血及渗出,罕见中性粒细胞。SMp组肺损伤介于V组与Mp组之间。见图1。

表2 各组大鼠W/D、LPI、AIR、ICAM-1、MPO 的比较()

表2 各组大鼠W/D、LPI、AIR、ICAM-1、MPO 的比较()

注:C组为对照组；V 组为机械通气组；Mp组为甲泼尼龙组；SMp组为SP600125+甲泼尼龙组；W/D 为湿/干比值；LPI为肺通透指数；AIR 为肺泡损伤率；ICAM-1为细胞间黏附分子-1；MPO 为髓过氧化物酶；与C组比较，a P ＜0.05；与V 组比较,b P ＜0.05；与Mp组比较,c P ＜0.05

组别 鼠数 W/D LPI(×10-3) AIR(%) ICAM-1(μg/L) MPO(U/g)C组 20 4.58±0.21 2.17±0.24 14.88±3.22 1.75±0.21 0.84±0.86 V 组 20 8.73±0.37a 5.41±0.51a 41.93±8.17a 6.48±1.51a 1.95±0.16a Mp组 20 4.74±0.21b 2.37±0.17b 15.75±3.44b 2.15±0.51b 0.89±0.95b SMp组 20 5.87±0.29abc 4.04±0.31abc 28.77±5.45abc 4.13±0.92abc 1.21±0.12abc F 值 4.05 3.78 12.95 4.10 3.14 P 值 0.01 0.02 0.00 0.01 0.02

表3 各组大鼠BALF中总蛋白、TNF-α、MIP-2浓度的比较()

表3 各组大鼠BALF中总蛋白、TNF-α、MIP-2浓度的比较()

注:C组为对照组；V 组为机械通气组；Mp组为甲泼尼龙组；SMp组为SP600125+甲泼尼龙组；BALF 为支气管肺泡灌洗液；TNF-α为肿瘤坏死因子-α；MIP-2为巨噬细胞炎性蛋白-2；与C组比较，a P ＜0.05；与 V 组比较,b P ＜0.05；与 Mp组比较,c P ＜0.05

组别 鼠数 总蛋白(mg/L) TNF-α(ng/L) MIP-2(ng/L)C组 20 335.12±24.5 74.36±4.21 138.85±19.32 V组 20 759.23±49.13a 152.39±9.19a 436.65±31.52a Mp组 20 359.36±28.25b 81.85±8.31b 146.39±26.22b SMp组 20 489.39±33.43abc 118.72±5.31abc 284.62±18.36abc F 值 19.45 13.68 12.53 P 值 0.00 0.00 0.00

2.5 各组大鼠肺组织JNK、p-JNK 蛋白及JNK m RNA 表达比较 4组大鼠肺组织JNK 表达水平差异无统计学意义(F=1.13,P＞0.05)；与C组比较,V 组和 SMp 组肺组织 p-JNK 和JNK m RNA 表达上调(F=3.78、3.29,P值均＜0.05),Mp组上述指标差异无统计学意义(F=3.78、3.29,P值均＞0.05)；与 V 组比较,Mp组与SMp组肺组织p-JNK 和JNK m RNA 表达下调(F=3.78、3.29,P值均＜0.05)；与 Mp组比较,SMp组肺组织p-JNK 和JNK m RNA 表达下调(F=3.78、3.29,P值均＜0.05),见表4、图2。

图1 肺组织病理学变化 HE ×200 A：对照组；B：机械通气组；C：甲泼尼龙组；D：SP600125+甲泼尼龙组

表4 各组大鼠肺组织JNK、p-JNK 蛋白及JNK m RNA 表达比较()

表4 各组大鼠肺组织JNK、p-JNK 蛋白及JNK m RNA 表达比较()

注:C组为对照组；V 组为机械通气组；Mp组为甲泼尼龙组；SMp组为SP600125+甲泼尼龙组；JNK 为c-Jun 氨基末端激酶；p-JNK为磷酸化JNK；与C组比较，a P ＜0.05；与V 组比较,b P ＜0.05；与Mp组比较,c P ＜0.05

组别 鼠数 JNK p-JNK JNK m RNA C组 20 0.73±0.04 1.04±0.15 0.38±0.03 V 组 20 0.75±0.07 2.91±0.44a 0.99±0.13a Mp组 20 0.71±0.05 1.25±0.22b 0.42±0.06b SMp组 20 0.78±0.09 1.96±0.31abc 0.71±0.09abc F 值 1.13 3.78 3.29 P 值 0.56 0.01 0.02

图2 各组大鼠肺组织JNK、p-JNK 表达水平

2.6 各组大鼠肺组织TUNEL 检测结果比较 C组未出现明显细胞凋亡,V 组TUNEL 阳性细胞表达明显增加,Mp组TUNEL阳性细胞表达明显降低,SMp组TUNEL阳性细胞表达介于V 组与Mp组之间。见图3。

3 讨论

一方面过度机械通气可直接造成肺组织发生机械损伤[4-8],另一方面还介导肺组织发生以炎性细胞浸润、细胞因子表达增加等改变的生物学损伤[9-11]。W/D、LPI 可反映肺组织的水肿情况,MPO 是由中性粒细胞分泌的血红素蛋白酶,其活性反映组织中性粒细胞激活程度[12]；ICAM-1 可促进白细胞黏附、扣押于肺泡区域,导致肺实质细胞损伤及持续细胞因子释放[13-14]；BALF中总蛋白浓度、TNF-α和MIP-2浓度反应肺组织炎症反应程度[15]。

本研究结果显示,随着机械通气时间的延长V组大鼠OI逐渐下降,T4时与C 组比较,V 组大鼠AI、W/D、AIR、LPI均明显升高,BALF 中总蛋白浓度、TNF-α和MIP-2浓度升高,MPO 与ICAM-1表达升高,肺组织病理损伤较重,细胞凋亡显著增加,提示大鼠大潮气量机械通气相关性肺损伤模型制备成功。本研究参照文献[16]并结合预实验结果选择甲泼尼龙的剂量与用法,依据文献[17]选择SP600125 的剂量与用法。研究结果显示,与V 组比较,Mp组随着机械通气时间的延长OI逐渐升高,T4时肺组织AIR、LPI、W/D、AI均降低,光镜下示肺组织病理学损伤减轻,TUNEL法示细胞凋亡减少,与Mp组比较,SMp组肺损伤较重。该结果提示甲泼尼龙具有肺保护作用,JNK 信号通路抑制剂一定程度上可逆转甲泼尼龙的肺保护作用。

MAPK 属于丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶类,主要位于真核细胞细胞质中,可将细胞外刺激信号传递到细胞核,可介导细胞间信息传递,在增殖、分化、转化、炎症以及凋亡等多种细胞过程中发挥关键性作用。 MAPK 有20多种亚型,如p38MAPK、JNK、细胞外信号调节激酶(extra cellular signal-regulated kinase,ERK)1/2、ERK5等。多种刺激可使MAPK 中的苏氨酸和酪氨酸残基磷酸化而活化MAPK[18],在被激活后,ERK 具有抗凋亡作用,JNK 和p38则具有促进炎症及凋亡作用。

图3 各组大鼠肺组织TUNEL 阳性细胞表达水平 TUNEL ×400 A：对照组；B：机械通气组；C：甲泼尼龙组；D：SP600125+甲泼尼龙组

大潮气量机械通气时肺组织细胞表面产生了过度的机械刺激,肺组织上皮细胞受到机械刺激后可使JNK 的苏氨酸和酪氨酸残基磷酸化进而激活JNK 通路,诱发相关炎性因子的合成与释放加重肺损伤[3]。本研究也得出相同的结果,V 组大鼠p-JNK 和JNK m RNA 表达明显高于C组。有研究显示,糖皮质激素可通过上调丝裂原活化蛋白激酶磷酸酶1表达来抑制JNK 信号通路活化,减少相关炎性因子的表达,减轻肺损伤[19-20]。我们的前期研究也同样发现甲泼尼龙可减轻大鼠机械通气相关性肺损伤与其抑制p38MAPK 磷酸化有关[21-23]。本研究结果显示,甲泼尼龙可下调大鼠肺组织p-JNK 和JNK mRNA 表达,可使肺损伤明显减轻,预先给予JNK 抑制剂SP600125皮下注射后甲泼尼龙的肺保护作用下降,该结果提示甲泼尼龙可通过抑制JNK 磷酸化来减轻大鼠机械通气相关性肺损伤,既往文献[19]报道支持该结果。

本研究中与V 组比较SMp组随机械通气时间的延长OI逐渐升高,T4 时肺组织LPI、W/D、AI、AIR 均降低,肺组织细胞凋亡减少,病理学损伤减轻,该结果提示SP600125并未完全逆转甲泼尼龙的肺保护作用,提示在JNK 信号通路以外还有别的信号通路参与了甲泼尼龙的肺保护作用。

综上所述,甲泼尼龙可通过抑制肺组织JNK磷酸化来减轻大鼠机械通气相关性肺损伤。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突