外泌体在气道慢性疾病中作用机制的研究进展

王玉秀 冯婷婷 陈众众 顾建军 闵凌峰

1江苏省苏北人民医院呼吸内科 大连医科大学第二临床学院,扬州225001;2江苏省苏北人民医院呼吸内科 扬州大学临床医学院,扬州225001

慢性气道炎症性疾病包括COPD 和哮喘[1]。其主要的病理表现为气道的慢性炎症反应和气道重塑现象。气道重塑主要表现为气道壁的增厚、基质胶原沉积以及上皮下纤维化等,在其发病过程中有多种细胞和炎性因子参与[2]。

外泌体是一类由多种细胞分泌的多形性囊泡样小体,直径约40～100 nm,广泛存在并分布于各类体液中,如血液、尿液、唾液、渗出液甚至羊水,且有较高浓度。细胞持续接触有害物质可能会改变外泌体的组成,并通过外泌体将信息传递给周围细胞[3],从而在气道慢性炎症性疾病的发生、发展中有一定的作用。这类体内广泛存在的纳米级囊泡结构小体可参与细胞之间或细胞与环境之间的物质、信息传递,在多种生理以及病理过程中发挥着重要的作用。不同组织部位细胞分泌的外泌体在其内容物的组成和功能均有相应的区别,有学者认为这种生物学差异受到其所处的细胞外环境的调控[3]。外泌体是由蛋白质、RNA、DNA以及少量脂类分子构成。其中蛋白质是外泌体内容物的主要组成部分：其中Annexins、Alix、Flotillin、Rab家族蛋白和TSG101等参与胞膜泡融合和运输的过程；蛋白激酶、G-蛋白等作为信号分子存在；CD63、CD9、CD81和CD82等跨膜区蛋白超家族成员则与外泌体的生成相关,它们是目前用来表征外泌体的标记物[4-5]；另外还包括分泌来源细胞的特异性蛋白等。近几年的研究发现,外泌体作为细胞间信号以及信息传递工具,在炎症反应、细胞转分化、细胞增殖以及细胞凋亡等过程中发挥重要的作用,在炎症性疾病、癌症等疾病的发生发展中有非常重要的作用。近年来有学者发现其在COPD、哮喘等慢性气道炎症疾病的发生发展中同样扮演一定的角色[6],明确外泌体在慢性气道炎症性疾病发病过程中的具体作用机制,可能为以后慢性气道炎症性疾病的诊治提供新的思路。下面将就外泌体在COPD 以及哮喘中的主要作用及具体机制作一综述。

1 外泌体可促进气道慢性炎症反应

慢性炎症在气道慢性疾病比如COPD 以及哮喘的病理过程中均有非常重要的作用,通常炎症过程的失调在它们稳定期以及进展期都有重要的作用。肺细胞包括气道上皮细胞、树突状细胞、巨噬细胞、CD4+以及CD8+T 淋巴细胞、自然杀伤细胞以及髓-单核调节细胞均可以调节肺部炎症反应,近期研究表明外泌体通过促进炎症以及免疫活性在这些疾病病理过程中有一定的作用[7]。在气喘患者,在其BALF分离出了外泌体,在哮喘发生、发展中有促进炎症以及免疫活性的作用[8]。COPD 同样是慢性炎性疾病,其肺部症状以及病理过程类似于哮喘,然而炎症机制有不同。气道刺激反应比如烟草烟雾激活肺泡Ⅱ型上皮细胞以及巨噬细胞促进炎症反应以及Th1/Th2细胞毒性反应。另外,这些细胞可通过胞内蛋白酶、促炎因子以及microRNA 而促进肺泡壁的损害,以及小气道壁的纤维化,而导致肺气肿的发生[9]。

在外界刺激包括烟草烟雾、感染、机械性损伤等的刺激下,可促进气道细胞包括支气管上皮细胞、内皮细胞等释放大量外泌体,其中包含有抗原、共刺激物以及一些促炎因子,可以完成细胞间的信号传递,从而诱导细胞的迁移、凋亡以及细胞因子的释放以及其他炎症诱导作用。在外周淋巴细胞,这可以诱导特异性免疫反应以及先天性免疫反应。

肺外泌体可来源于不同类型细胞,其中包括支气管上皮细胞以及肺部免疫细胞,比如肺巨噬细胞、树突状细胞等[10],在气道炎症反应中有一定的作用。支气管上皮细胞是肺外泌体的主要来源,支气管上皮细胞是气体交换的第一道屏障,在烟草烟雾等外界刺激下,首先刺激支气管上皮细胞外泌体的分泌以及释放[11]；有体外实验研究显示,IL-13刺激的支气管上皮细胞外泌体的释放可促进单核细胞的增殖[12]。在气道慢性炎症性疾病,巨噬细胞的数量明显增加,肺泡巨噬细胞来源的外泌体可抑制细胞因子信号蛋白的转运,并且可以抑制干扰素-γ(interferon-γ,IFN-γ)诱导的信号传感器的转录及翻译,这都显示巨噬细胞来源外泌体在气道慢性炎症中有一定的作用[13]。细菌刺激的巨噬细胞来源的外泌体在体内可诱导记忆CD4+以及CD8+T细胞反应。在吸烟者低氧刺激下,外周血内皮细胞来源的外泌体明显增加,可促进大量促炎成分以及细胞因子的释放[14]。嗜酸粒细胞来源的外泌体可增强IFN-γ 的刺激作用。有研究者发现在哮喘患者,嗜酸粒细胞的释放增加了携带大量颗粒蛋白的外泌体数量。活性中性粒细胞释放含有颗粒蛋白髓过氧化物酶的外泌体,并能将花生四烯酸输送到受体的血小板中。在脂质介导下,中性粒细胞与血小板之间信息交流明显增强在炎症过程中[15]。肥大细胞来源的外泌体可以诱导B淋巴细胞以及T 淋巴细胞的增殖,以及树突状细胞的成熟。在抗原刺激后,外周树突状细胞可产生带有p MHC-Ⅱ的外泌体。这些树突状细胞来源的外泌体可以通过与树突状细胞以及B细胞相互作用而激活T 细胞并调节它们的极性。另外,巨噬细胞以及树突状细胞来源的外泌体还可以增强多核巨细胞的迁移,并且这些外泌体内包括含有白介素合成酶而促进炎症因子的分泌而促进炎症反应[16]。

在烟草烟雾、感染等外界刺激下,外泌体内容物如蛋白质、RNA 和少量脂类分子等在气道慢性炎症过程中同样有非常重要的作用。一方面,外泌体自身包含有大量炎性因子,研究显示,外泌体内包含有IL-1β的存在,而气道IL-1β水平增加可促进炎症反应以及诱导巨噬细胞基质金属蛋白酶的合成,在气道慢性炎症以及气道重塑中扮演一定的角色[17]。另外,外泌体内容物microRNA,如miR-15b、miR-223、miR-210等在气道炎症反应中有一定作用[18]。再者,外泌体内部分蛋白同样可促进气道慢性炎症,其中CCN1作为一基质相关的CCN 家族蛋白,在烟草烟雾刺激后支气管上皮细胞来源外泌体内存在大量CCN1,其可溶解形式可通过Wnt信号通路刺激IL-8的产生,而募集炎症细胞到肺实质,在气道慢性炎症反应中有一定的作用[19]。因此外泌体也许可作为炎症细胞募集的主要介质在气道炎症反应中起一定的作用。

在气道慢性炎症过程中,外泌体一方面作为细胞间主要信息传导工具之一,可促进气道上皮以及内皮细胞与各个免疫细胞间的信号传导而促进外界烟雾、感染等刺激下的气道炎症反应；另一方面外界不良因素刺激下气道细胞外泌体分泌释放增加,其内容物(RNA、DNA、蛋白酶等)在促进气道慢性炎症中同样有重要的作用(图1)。

2 外泌体可促进气道重塑反应

图1 外泌体促进气道慢性炎症机制示意图

气道重塑是慢性炎症性气道疾病的一主要病理表现,就目前研究,其主要的作用机制有：(1)在外界刺激下,促进气道蛋白酶[如基质金属蛋白酶2(matrix metalloproteinase-2,MMP-2)和 MMP-9 等]分泌,促进气道纤维化从而导致气道重塑；(2)在外界烟雾、感染等刺激下,产生部分细胞因子,比如活性氧成分等通过作用于转化生长因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)等因子而促进气道上皮细胞的间质转化,从而促进气道重塑；(3)在各种细胞因子的刺激下,促进气道平滑肌增殖以及表型转化,同样在气道重塑中有非常重要的作用,近年来的研究显示,外泌体作为细胞间信号传递的主要工具,在慢性气道炎症性疾病气道重塑作用机制中有非常重要的作用[20]。

外泌体内含有大量蛋白质以及其他分子,并且在胞外环境中保护它们免受降解酶的降解[21]。之后随外泌体很快转运到远处目标细胞,并且其表面的标记物使它们与目标细胞融合并内化,从而影响目标细胞的功能。有研究显示在脂多糖等刺激下,其可促进气道中性粒细胞分泌释放外泌体,并且转移到气道平滑肌细胞,使其被平滑肌细胞内化,促进气道平滑肌细胞的增殖,从而促进气道重塑[22]。另外,他们的研究还显示在中性粒细胞来源外泌体中大量蛋白酶如MMP-9和血管内皮生长因子受体3 的存在,同样在气道重塑中扮演非常重要的作用[23]。除中性粒细胞外,烟草烟雾刺激同样可诱导支气管上皮细胞分泌的外泌体,可以调控成纤维细胞分化,同样在气道重塑中有非常重要的作用[24]。有研究发现在脂蛋白刺激下,气道上皮细胞外泌体分泌释放明显增加,可促进蛋白酶的细胞外转运,一方面促进气道成纤维细胞的肌纤维分化,另一方面可通过Toll样受体4信号作用调节气道上皮细胞的间质转化,因此促进气道重塑[20]。另外,支气管成纤维细胞积极参与细胞外基质的稳态维持,上皮屏障功能,修复机制和白细胞迁移。它们可以调控外周上皮细胞的增殖与分化。有研究证实了支气管成纤维细胞在上皮细胞促进下释放外泌体的能力,并且支气管成纤维细胞分泌的外泌体包含有细胞因子、化学因子以及其他生长因子,在这些因子作用下,使成纤维细胞TGF-β表达减少,促进气道上皮细胞间质转化,从而在气道重塑过程中起一定的作用[24]。

在烟草烟雾、脂蛋白、过敏原等外界刺激下,气道支气管肺泡细胞以及免疫细胞外泌体分泌增加,一方面快速转运到目标细胞,比如肺支气管平滑肌细胞,调控目标细胞功能,促进其增殖,在气道重塑中扮演重要的角色。再者外泌体包含有大量蛋白酶、DNA、RNA 等分子,在MMP等的作用下,促进气道成纤维细胞肌纤维化,进一步促进气道重塑。另外,外泌体同样包含有大量细胞因子、化学因子以及生长因子等,可通过调控TGF-β的表达而促进气道上皮细胞间质转化,同样在气道重塑中扮演重要的角色(图2)。

3 外泌体在COPD作用机制中的研究

COPD 是一种以气道慢性炎症以及气道重塑为主要病理特征的起到慢性炎症性疾病,是呼吸内科常见疾病,多发于老年患者,且近年环境污染的加重,其发病率也逐年上升。临床主要表现为气急、咳嗽、咳痰并常伴呼吸衰竭等。肺功能检查多以持续气流受限,且不完全可逆为特征[25]。众所周知,烟草烟雾等外界刺激在COPD 的发生、发展中有至关重要的作用,气体交换是维持机体正常生理活动主要的过程之一,其有赖于较大的气血接触面,不可避免的与外界危险因子的接触包括颗粒、病原体以及化学刺激物。气道的保护措施包括解剖屏障,纤毛上皮、黏液的诱导捕获入侵者以及遍布于气道的固有以及获得性免疫细胞[26]。而外泌体作为一囊样结构,研究显示在烟草烟雾、病原体等刺激下,气道上皮细胞分泌外泌体的量明显增加,同时在COPD 气道慢性炎症以及气道重塑等病理过程中扮演重要的角色[27]。

气道慢性炎症是COPD 主要的病理学特性之一,烟草烟雾以及其他刺激作用刺激气道上皮细胞以及巨噬细胞释放细胞因子以及生长因子而促进COPD 慢性炎症反应。另外,激活的巨噬细胞可通过募集中性粒细胞、Th1 以及Tc1亚型以及分泌蛋白酶而促进炎症反应。有研究表明,在烟草烟雾提取物(cigarette smoke extract,CSE)处理后,肺上皮细胞分泌外泌体的量明显增加,并且外泌体内有CCN1的存在[28]。而CCN1 是CCN 家族蛋白之一,其可通过多种信号功能影响细胞的生存以及生长,他们就发现CCN1的可溶性形式可以通过Wnt信号通路刺激IL-8的产生,进而募集炎症细胞到肺实质,导致肺部炎症的发生,因此外泌体包含的CCN1也许在促进气道炎症反应有类似的作用[19]。另外,microRNA 作为外泌体主要内容物之一,有研究发现其在气道慢性炎症反应中有一定的作用,已有研究显示在CSE 处理的支气管上皮细胞分泌的外泌体内miR-210的表达上调,可刺激气道炎症因子例如肿瘤坏死因子-α、IL-6、IL-1β等的分泌,从而刺激气道慢性炎症反应[29]。综上均证明了外泌体在COPD 气道慢性炎症反应中的重要作用。

图2 外泌体促进气道重塑机制示意图

COPD 是一种慢性非可逆气道炎症性疾病,其最终状态即为气道重塑、小气道壁的纤维化以及肺泡腔的破坏,导致肺气肿的发生。在香烟烟雾等外界刺激下,上皮细胞分泌的TGF-β和成纤维生长因子等可促进纤维细胞的增生以及小气道的纤维化[30]。另外,COPD 患者气道IL-1β的水平是明显升高的,其可促进气道炎症反应,同时可促进基质金属蛋白酶的产生。而已经有研究在人以及小鼠气道细胞分泌的外泌体内发现IL-1β以及MMP-9的存在[31-32],其均在促进气道纤维化中扮演重要的角色。另外,大量研究表明多种miRNAs参与COPD 的发生发展,包括miR-15b、miR-223、miR-1274a、miR-424 以及 miR-210,这些miRNAs也许包含在外泌体内并且改变受体细胞的功能[7],特别的,已经有研究在CSE处理的支气管上皮细胞分泌的外泌体内发现miR-210的表达上调,并且这些miR-210相关的外泌体可通过拮抗ATG7而抑制自噬反应以及促进纤维细胞的肌纤维化在肺气肿的发生、发展中发挥重要的作用[33]。

4 外泌体在哮喘作用机制中的研究

哮喘是一种症状多样的气道慢性炎症性疾病,主要以气喘、呼吸困难以及胸部紧迫感为主要临床特点,主要表现为可逆性的气流受限、气道高反应性、外周Th2-介导的气道炎症以及气道重塑。气道重塑主要包括气道上皮细胞的改变、上皮下胶原蛋白的沉积、细胞外基质的破坏以及支气管平滑肌细胞的增生[34]。这些导致的结果就是气道壁的增厚促进气道炎症反应,最终导致哮喘急性发作。哮喘的发展意味着气道平滑肌细胞的收缩、增生、肥大、化生以及迁移[35]。近期研究显示,外泌体可参与并介导免疫应答、抗原呈递、炎症反应和细胞迁移等多种病理生理过程[36]。其可参与哮喘患者的炎症反应过程和细胞间通讯过程,在哮喘发病过程中均发挥作用。

Park等[37]研究结果显示哮喘患者较健康对照者在BALF分泌有大量外泌体,并证明在外界刺激下由支气管上皮细胞分泌,促进组织因子分泌到支气管,在哮喘气道慢性炎症中有重要的作用。另外,Paredes等发现在轻度桦树花粉过敏性哮喘患者BALF 外泌体CD63、CD81、CD36、HLA-DR 蛋白水平明显高于正常对照组,其在哮喘患者中表现出不同的表型及功能；进一步发现来自哮喘的BALF外泌体可增加支气管上皮细胞中组织因子的形成和IL-8的释放,而半胱氨酰白三烯受体拮抗剂孟鲁司特能降低外泌体诱导的IL-8释放,因此BALF外泌体也具有支气管上皮细胞中组织因子生物合成能力,参与哮喘的炎症反应。

外泌体在细胞间通讯中发挥重要的作用,它可以穿过质膜将其内容物卸载,进而影响细胞的表型及功能。不同细胞来源的外泌体,其功能也就不同[38]。与哮喘有关的外泌体产物主要由嗜酸粒细胞、巨噬细胞、树突状细胞、上皮细胞及淋巴细胞产生,其中众所周知,嗜酸粒细胞是哮喘中的重要效应细胞,它通过释放含有多种炎症因子的颗粒来发挥作用[39]。其中的一些颗粒即为外泌体,它是细胞外的纳米囊泡,直径约30～120 nm,并且包含有多种分子,其中包括核酸(DNA、microRNA、RNA)、蛋白以及脂质介质。有研究显示,哮喘患者的嗜酸粒细胞来源的外泌体可以影响肺结构细胞的功能,改变细胞一些生理过程以及改变多种促炎因子的表达[40],他们还发现外泌体可显著降低信号转导与转录激活因子3以及丝氨酸/苏氨酸激酶AKT 因子的磷酸化,与此同时,这些细胞的凋亡水平增加以及伤口修复水平降低,从而在哮喘患者气道重塑中有重要的作用[41]。Rossaint等[42]发现B淋巴细胞中可以分离出外泌体,并证明外泌体在体内表现为抗原呈递作用,诱导T 细胞的反应,参与免疫细胞的调节。同样的,Kulshreshtha等[43]发现在IL-13的影响下,上皮细胞来源的外泌体可诱导哮喘炎症条件下肺内未分化巨噬细胞的增殖和趋化,从而在哮喘发生发展中扮演一定角色。Du等[44]发现衍生自抗原呈递细胞的外泌体能在细胞表面表达主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex-Ⅰ,MHC-Ⅰ)和MHC-Ⅱ类分子,有助于激活CD4+T 细胞和CD8+T 细胞以诱导特异性免疫应答,在哮喘患者气道炎症反应中扮演一定的角色。

综上所述,外泌体作为细胞间信号传递的主要工具之一,在气道慢性炎症疾病尤其是COPD、哮喘等的发生、发展中有重要的作用,但外泌体是否可作为COPD、哮喘等慢性气道炎性疾病的诊断或预后评估的指标之一,尚未得到一定的证实。同时外泌体在COPD、哮喘等慢性炎症性疾病的慢性气道炎症以及气道重塑等病理特征中的具体作用机制还需进一步的研究。外泌体的研究也许可以为慢性气道炎症性疾病的临床诊断以及治疗提供新的思路。

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