正交法优化ZnO/MMT抗菌材料制备条件及抑菌活性研究

麻晓霞，高灵娟，马玉龙，翟喜会，杨青萍，马春香

(宁夏大学化学化工学院，省部共建煤炭高效利用与绿色化工国家重点实验室，银川 750021)

1 引 言

微生物细菌污染对饲料、食品、牲畜和人类健康造成了危害，尤其是存在于食品、饲料中的病原菌，如沙门氏菌(Salmonella)，大肠杆菌(E.coli)、金黄色葡萄球菌(S.aureus)等已成为畜禽养殖业发展及公共卫生安全的重点监测对象[1]。许多动物会被感染且垂直传播，并伴有交叉污染情况[2]；而大量使用抗生素会使其产生耐药性，也给耐药病原菌防治带来新的问题。近年来，抗菌材料以其应用范围广、安全性高、有效期长等优点，可以有效降低细菌的交叉传染[3]。

基于纳米氧化锌良好的抗菌活性[4]，若将氧化锌负载于具有特殊功能的载体上不仅可以保持抗菌剂固有的特性、增强其稳定性，还有利于回收和重复使用，降低成本，增加其抗微生物功效的持续时间。常见抗菌材料的载体主要有沸石类、蒙脱石类、硅胶类以及磷酸盐类等[5]。蒙脱石(montmorillonite，MMT)是一种硅铝酸盐矿物，有良好的离子交换性、吸附性和膨胀性[6]，在动物饲粮中适量添加MMT，能维护家禽肠道屏障功能，改善肠道健康，加快禽畜生长[7]。笔者通过正交试验制备蒙脱石负载氧化锌抗菌材料，探究ZnO/MMT抗菌材料制备条件的影响因素，并对所选菌种进行抑菌实验，为动物疾病预防和治疗提供参考。

2 实 验

2.1 材 料

粗钙基蒙脱石(97%)，购于内蒙古赤峰市和明生化工有限公司；锌试剂、氯化锌和氢氧化钠等化学试剂均为分析纯，购于天津市凯通化学试剂有限公司；沙门氏菌(ATCC 14028)、大肠杆菌(ATCC 25922)和金黄色葡萄球菌(ATCC 6538)均购于国家微生物保藏中心。

2.2 实验设计

选用反应物物料配比(1∶1，1∶2，1∶4，1∶8)、反应温度(70 ℃，80 ℃，90 ℃，100 ℃)和反应时间为(18 h，24 h，30 h，36 h)为抗菌材料制备条件。以反应物物料配比(因素A)、反应温度(因素B)、反应时间(因素C)为考察因素，每个因素以最小抑菌浓度(MIC)、最小杀菌浓度(MBC)为实验研究指标，采用L16(45)设计正交表，ZnO/MMT抗菌材料制备因素水平如表1所示。

表1 正交试验因素水平设计Table 1 Factors and levels in the orthogonal experiment designs

2.3 ZnO/MMT抗菌材料的制备

取粗品钙基蒙脱石，加去离子水，搅拌1 h，静置3 h，弃上清液和底部杂质，重复上述操作3～5次，收集悬浮液，离心分离，所得固体于70 ℃下干燥，研磨粉碎后过300目标准筛，即得蒙脱石纯品(MMT)。

取一定量氯化锌和氢氧化钠溶于去离子水中，水浴恒温振荡，加入蒙脱石纯品，搅拌后离心分离，去离子水洗涤3次，过夜干燥，125 ℃煅烧2 h，粉碎后过300目标准筛，即得载氧化锌蒙脱石抗菌材料(ZnO/MMT)。

2.4 抗菌材料的表征

使用X射线衍射仪(XRD，Bruker D8)获得材料晶体结构性质，X射线源为Cu Kα辐射。利用N2物理吸附仪(BET，JW-BK132F)测定样品的孔结构特征。采用扫描电子显微镜(SEM，JSM-7500F)观察样品改性前后结构形貌变化及团聚情况。

2.5 抗菌材料MIC及MBC的测定

取不同浓度梯度的抗菌材料及提纯MMT于试管中，加适量稀释后菌种、液体培养基，混匀，置于培养箱中培养数小时，将未见细菌生长浓度记为材料的最小抑菌浓度(MIC)。从未见细菌生长的试管中取少量上层溶液至已凝固的固体培养基中，在恒温培养箱中培养。固体培养基上未见细菌生长或者菌落数小于5的浓度记为材料的最小杀菌浓度(MBC)。

2.6 抑菌圈法对抗菌材料抑菌性能的测定

移取100 μL二代菌悬液于无菌固体培养基中，涂布均匀，放入直径为1 cm的无菌压片，37 ℃倒置培养24 h，用直尺测量抑菌环直径(不包括压片)。以MMT为阴性对照进行空白试验。

3 结果与讨论

3.1 极差分析法

以沙门氏菌为试验菌种，MIC和MBC为测试指标，极差分析[8]该抗菌材料的抑菌性能。由表2可知，物料配比、反应温度、反应时间对MIC的影响程度依次为RB>RA>RC。同理，运用极差分析法计算了MBC对应的RA、RB、RC依次为0.512、1.024、0.448，显著性与MIC一致。

表2 抗菌材料对沙门氏菌的MIC和MBC实验结果Table 2 MIC and MBC of antibacterial materials against Salmonella

3.2 方差分析法

方差分析法是一种利用实验数据确定因素影响显著性差异的统计分析技术[9]。以MIC研究指标进行方差分析(如表3所示)。物料配比、反应温度、反应时间对抗菌材料MIC影响的显著性依次为B>A>C，方差分析结论与极差分析结果一致。以MIC为研究指标，根据最优水平组合的优选原则[10]确定最优制备条件为实验组合A4B1C1，即氯化锌与氢氧化钠比为1∶8，反应温度为70 ℃，反应时间为18 h。采用锌试剂分光光度法检测了最优条件下所制备ZnO/MMT的中Zn的负载量为6.14wt%。

表3 MIC方差分析结果Table 3 MIC analysis of variance results

3.3 材料测试分析

图1为MMT和不同温度下ZnO-MMT复合抗菌材料的XRD图谱。由图1可知，MMT的对应晶面(001)在衍射角为5.9°时，其晶面间距为1.49 nm，属钙型蒙脱石。MMT负载ZnO后，特征衍射峰未发生明显变化，说明负载后的MMT仍为钙型蒙脱石。根据JCPDS卡片对比，在31.7°、34.4°、36.2°左右均发现有ZnO晶体(100)、(002)和(101)的晶面衍射，说明在蒙脱石表面或内部有ZnO生成，这与文献[11]的测定结果相符。随着反应温度的升高，ZnO晶体的衍射角和晶面间距基本不变，但衍射峰强度发生变化，且在70 ℃时强度最大，说明70 ℃时ZnO/MMT复合抗菌材料中ZnO晶体数量最多。晶相分析表明：ZnO在蒙脱石表面或内部生成，与蒙脱石载体表面牢固结合形成稳定的复合物，二者存在着较强的界面关系。

图1 MMT and ZnO/MMT的X射线衍射图Fig.1 XRD patterns of MMT and ZnO/MMT samples

研究了不同温度该抗菌材料的比表面积、孔体积及孔径分布(表4)。与MMT相比， ZnO/MMT的孔体积增大，孔径减小，这可能是由于ZnO微粒堆积形成小孔，使材料孔体积变大，微粒吸附于MMT孔道内导致材料孔径变小所致[12]。在70 ℃时，ZnO/MMT比表面积为53.7534 m2/g，较80、90和100 ℃条件下制备的ZnO/MMT的比表面积大很多，且孔径最小，说明随着反应温度的升高，ZnO微粒可能发生了团聚，导致孔径变大，孔体积变小。负载ZnO前后蒙脱石孔结构的变化显示ZnO在蒙脱石表面或内部均有生成，这与XRD表征的结果一致。

表4 材料的比表面积孔体积和孔径Table 4 Specific surface area, pore volume and pore size of materials

图2 MMT(a)和ZnO/MMT(b-e)复合抗菌材料和的SEM图Fig.2 SEM images of MMT (a) and ZnO/MMT (b-e) composite antibacterial materials

图2a-e分别为载体MMT和制备温度为70 ℃、80 ℃、90 ℃和100 ℃下ZnO/MMT复合抗菌材料的SEM图。由图2a可知蒙脱石载体形貌呈片层结构。在70 ℃时，ZnO晶体以针状和棒状的形态吸附在MMT片层表面及空隙中，较为疏松(图2b)。升高温度，ZnO晶体的形貌特征不再明显，空隙消失，发生团聚现象(图2c-e)。这可能由于煅烧温度调控了纳米氧化锌颗粒的粒径，使其表面能高、表面张力大，从而使纳米氧化锌颗粒团聚[13]。

3.4 ZnO/MMT的广谱抑菌活性

广谱活性是评价抗菌材料的重要依据之一。因此，研究了最优制备条件下ZnO/MMT复合抗菌材料对沙门氏菌、大肠杆菌及金黄色葡萄球菌的抑菌效果，见图3所示。作为阴性对照，MMT对这三种菌的生长无抑制作用，而ZnO/MMT复合材料对三个菌种均发现明显的抑菌圈，说明该条件下制备的ZnO/MMT对沙门氏菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的生长均具有广谱抑制效果，其抗菌机理可能是复合材料细菌直接相互作用，引起细菌表面损伤，继而导致菌膜破裂最终引发细菌死亡[14]，抗菌机理的深入研究还在进行中。

同时，还研究了该材料对三个菌种的MIC和MBC。由表5可知，ZnO/MMT对各试验菌株均表现出一定程度的抑制能力，这一结论与抑菌圈实验结果一致。抑菌活性顺序为：沙门氏菌>金黄色葡萄球菌>大肠杆菌。

图3 MMT(a)和ZnO/MMT(b，c和d)的抑菌圈试验Fig.3 Inhibition zone test of MMT (a) and ZnO/MMT (b, c and d)

Salmonella/mg·mL-1MICMBCE.coli/mg·mL-1MICMBCS.aureus/mg·mL-1MICMBC1.603.206.402.803.202.80

4 结 论

以蒙脱石为载体，采用离子交换法和共沉淀法制备了ZnO/MMT抗菌材料。通过正交实验筛选出ZnO/MMT最优制备条件，即氯化锌与氢氧化钠比为1∶8，反应温度为70 ℃，反应时间为18 h。抑菌实验表明，ZnO/MMT抗菌材料对沙门氏菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均具有较好的广谱抗菌活性。