成红细胞样Ter细胞在胶原诱导性关节炎发病中的作用

王 平，宋 婧，方翔宇，李 鑫，刘 栩，贾 园，栗占国,2，胡凡磊,2△

(1. 北京大学人民医院风湿免疫科，风湿病机制及免疫诊断北京市重点实验室， 北京 100044； 2. 北京大学药学院天然药物及仿生药物国家重点实验室， 北京 100191)

类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是一种慢性炎症性自身免疫性疾病，主要累及关节部位，是临床常见的主要致残性疾病之一[1]。RA的发病机制复杂，遗传、环境、微生物等多种因素均参与RA的发生，多种免疫细胞参与并介导了RA的发生和发展[2]：CD4+T细胞亚群的失衡参与RA炎症的发生和持续过程[3]；B细胞过度分化为浆细胞产生大量自身抗体，参与炎症的发生[4]；调节性B细胞功能失调参与RA发病[5]；骨髓来源的抑制性细胞(myeloid-derived suppressor cells，MDSCs)促进炎症反应及骨破坏，加重RA病情[6]。

2018年Han等[7]在荷瘤小鼠中发现了一个新细胞亚群——成红细胞样Ter-119+细胞(Ter细胞)， 研究表明该群细胞来源于巨核-红系，主要存在于脾脏中，在肝癌状态下数量明显增加，并且可通过分泌artemin促进肝癌的进展。但关于Ter细胞在自身免疫病尤其是RA中的作用尚未见报道。

鉴于Ter细胞主要存在于脾脏中，RA患者的临床样本难以获得，因此，本研究选择在胶原诱导性关节炎(collagen-induced arthritis，CIA)小鼠模型[8]中进行研究，旨在通过研究Ter细胞在不同发病阶段CIA小鼠中的数量变化及其与关节评分和T、B细胞亚群比例的相关性，探索Ter细胞在CIA发生和发展中的作用，从而进一步深入理解RA的发病机制。

1 资料与方法

1.1 实验动物

无特定病原体(specific pathogen free，SPF)级6～8 周DBA/1雄性小鼠和Balb/c雄性小鼠购于北京华阜康生物科技股份有限公司，SPF级6～8周C57BL/6雄性小鼠购于北京维通利华实验动物技术有限公司，均寄养于北京大学人民医院动物实验室SPF级环境，适应性饲养1周后进行实验。

1.2 主要试剂和仪器

流式细胞仪FACSAriaⅡ由美国BD公司制造，流式细胞仪CytoFLEX LX由美国Beckman Coulter公司制造；荧光标记的抗鼠CD45(FITC标记)、抗鼠Ter-119(APC标记)、抗鼠CD4(APC-Cy7标记)、抗鼠干扰素γ(interferon，IFN-γ，PerCP-Cy5.5标记)、抗鼠CD19(PerCP-Cy5.5标记)、抗鼠GL-7(Pacific Blue标记)、抗鼠CD138(APC标记)抗体均购自美国Biolegend公司；荧光标记的抗鼠白细胞介素(interleukin-17，IL-17，PE标记)、抗鼠FoxP3(PE标记)、抗鼠CD5(APC标记)、抗鼠CD1d(PE标记)、抗鼠CD95(Alexa Fluor 488标记)购自美国eBioscience公司；牛Ⅱ型胶原(bovine type Ⅱ Collagen，CⅡ)、完全弗氏佐剂(complete Freund’s adjuvant，CFA)、不完全弗氏佐剂(incomplete Freund’s adjuvant，IFA)购自美国Chondrex公司；FACS Permeabilizing Solution购自美国BD公司；FoxP3/Transcriptn Factor Staining Buffer Set购自Thermo Fisher Scienti-fic 公司；FCM Lysing solution、4%(质量分数)多聚甲醛(paraformaldehyde，PFA)、佛波酯(phorbol-12-myristate-13-acetate，PMA)、离子霉素(ionomycin)和布雷非德菌素A(brefeldin A，BFA)均购自杭州联科生物技术股份有限公司。

1.3 CIA造模、分组及评分

1.3.1造模 CⅡ用100 mmol/L冰醋酸溶解4 ℃过夜，与CFA按照1 ∶1的体积比混合，充分乳化。在小鼠尾根部分两点进行皮下注射，各注射含100 μg CⅡ的乳化液；初次免疫后第21天，CⅡ和IFA按照1 ∶1的体积比充分乳化，在小鼠尾根部皮下注射含100 μg CⅡ的乳化液，完成CIA模型的诱导。

1.3.2分组 本次实验共构建40只CIA模型小鼠，在二次免疫后5 d发病率约为50%，挑选评分相近的小鼠，随机分入发病早期、高峰期和晚期3组，共挑选出18只小鼠，每组6只。发病高峰期小鼠根据最终关节评分以8分为界再细分为高评分组和低评分组。

1.3.3评分 分别对小鼠的四只爪子进行评分，每只爪子的评分标准如下： 0分，无关节红肿；1分，1～2个脚趾/手指肿胀或掌心肿胀或腕/踝部肿胀；2分，超过2个脚趾/手指肿胀或达到任意2个1分的条件；3分，达到3个1分的条件或超过2个脚趾/手指肿胀且有掌心或腕/踝部肿胀；4分，超过2个脚趾/手指肿胀且有掌心和腕/踝部肿胀。每只爪子最高为4分，整体评分最高16分。

1.4 流式细胞术检测小鼠脾脏Ter细胞、生发中心(germinal centers，GC)-B细胞和B10细胞

小鼠异氟烷吸入麻醉后以颈椎脱臼的方式安乐死，取脾脏，研磨、裂红、洗涤，制备单细胞悬液。检测Ter细胞加入抗鼠CD45-FITC和Ter-119-APC流式抗体，检测GC-B、B10细胞加入抗鼠CD19-PerCP-Cy5.5、CD5-APC、CD1d-PE、CD95-Alexa Fluor 488、GL-7-Pacific Blue流式抗体，检测浆细胞加入抗鼠CD19-PerCP-Cy5.5、CD138-APC流式抗体。振荡混匀后室温避光孵育30 min，洗涤后重悬，上机检测。

1.5 流式细胞术检测小鼠脾脏Th1、Th17和Treg细胞

1.5.1检测Th1、Th17细胞 制备小鼠脾脏单细胞悬液，离心后完全1640培养基重悬细胞，加入PMA、离子霉素和BFA，混匀，37 ℃细胞培养箱孵育5 h。5 h后加入抗鼠CD4-APC-Cy7抗体，振荡混匀后室温避光孵育30 min，固定、破胞膜，加入抗鼠IL-17-PE和IFN-γ-PerCP-Cy5.5抗体，振荡混匀后室温避光孵育30 min，洗涤后重悬，上机检测。

1.5.2检测Treg细胞 制备小鼠脾脏单细胞悬液，加入抗鼠CD4-APC-Cy7抗体，振荡混匀后室温避光孵育30 min，FoxP3 Staining Buffer set破核膜，然后加入抗鼠FoxP3-PE抗体，振荡混匀后室温避光孵育30 min，洗涤后重悬，上机检测。

1.6 统计学分析

所有实验数据均采用Prism 7软件进行处理、分析。各个阶段CIA小鼠之间及其与naïve小鼠Ter细胞比例差异采用One-way ANOVA分析，然后采用Tukey’s多重比较检验进行两两比较；高峰期两组CIA小鼠Ter、Th1、Th17、GC-B细胞比例差异采用Welch’st检验分析；Ter细胞比例与各T、B细胞亚群比例的相关性采用Pearson分析(双侧检验)，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Ter细胞在不同品系小鼠脾脏中的分布

流式细胞仪检测Ter细胞的圈门策略如图1所示，DBA/1、Balb/c、C57BL/6三种品系naïve小鼠脾脏中均存在Ter细胞，但在DBA/1小鼠脾脏中比例最高。

2.2 Ter细胞在发病高峰期CIA小鼠中明显扩增

鉴于DBA/1小鼠是公认的构建CIA模型的小鼠品系，并且上述实验结果显示DBA/1小鼠脾脏中Ter细胞的比例最高，因此我们选择DBA/1小鼠进行了CIA模型的构建。流式细胞仪检测6只naïve和6只发病高峰期CIA小鼠脾脏Ter细胞，结果显示发病高峰期CIA小鼠脾脏Ter细胞比例较naïve小鼠明显升高(8.522%±2.645%vs. 1.937%±0.725%，P<0.01，图2)。

A,gating strategies for Ter cells in the spleen of mice; B, the frequencies of Ter cells in C57BL/6, Balb/c and DBA/1 mice.图1 Ter细胞在不同品系小鼠脾脏中的分布Figure 1 Distribution of Ter cells in the spleen of different strains of mice

CIA, collagen-induced arthritis. Frequencys of Ter cells in the spleen of naïve and CIA mice. Ter cells were increased markbly in CIA mice compared with naïve mice.图2 Ter细胞在发病高峰期CIA小鼠中明显增加(n=6)Figure 2 Ter cells were significantly increased in CIA mice (n=6)

2.3 发病高峰期Ter细胞比例与CIA关节评分及T、B细胞亚群比例的相关性分析

根据关节评分将发病高峰期CIA小鼠分为两组，以8分为分界线，评分≤8分为低评分，评分>8分为高评分。比较两组小鼠脾脏Ter、Th1、Th17、GC-B细胞的比例，结果显示，高评分组小鼠脾脏Ter细胞比例明显低于低评分组(6.217%±0.841%vs. 10.827%±0.917%，P<0.01)。高评分组小鼠脾脏Th1细胞比例明显高于低评分组(1.337%±0.110%vs. 0.727%±0.223%，P<0.05)，高评分组小鼠脾脏Th17细胞比例高于低评分组(0.750%±0.171%vs. 0.477%±0.051%，P=0.099)， 高评分组小鼠脾脏GC-B细胞比例明显高于低评分组(1.243%±0.057%vs. 1.097%±0.015%，P<0.05)，提示高峰期CIA小鼠脾脏Ter细胞比例与T、B细胞及其亚群比例可能存在相关性(图3)。进一步的相关性分析结果显示，发病高峰期CIA小鼠脾脏Ter细胞比例与CD4+T、Th1、Th17、GC-B细胞比例均呈强负相关，与B10细胞比例呈强正相关，初步提示这群细胞在CIA中可能具有保护作用(图3)。

A, The differences of the frequencies of Ter, Th1, Th17 and GC-B cells between the mice with high score and low score at the peak stage of CIA； B, Correlation analysis of Ter cell frequencies with T and B cell subsets.图3 CIA发病高峰期Ter细胞比例与关节评分及T、B细胞亚群的相关性分析Figure 3 Correlation analysis of Ter cell frequencies with joint score, T and B cell subsets

2.4 Ter细胞呈现动态变化，在CIA发病晚期比例降低

根据CIA发病时间和关节评分将CIA分为发病早期(发病1～2天，评分≤2分)、高峰期(发病15 d左右)、晚期(发病60 d以上)。流式细胞仪检测各个阶段CIA小鼠脾脏Ter细胞比例，观察其动态变化过程。结果显示，晚期CIA小鼠脾脏Ter细胞比例明显低于高峰期(0.917%±0.588%vs. 8.522%±2.645%，P<0.001，图4)，进一步提示其可能作为一群免疫保护细胞参与CIA发病，但其具体作用及机制仍需后续进一步的体内及体外实验验证。

3 讨论

RA的发病机制复杂，多种免疫细胞及细胞因子参与其发病过程，之前的研究主要集中在淋巴系和髓系细胞，例如T细胞、B细胞、自然杀伤细胞等淋巴细胞及其亚群及MDSCs细胞的相关研究，但关于红系细胞在RA发病中的作用却未见报道。

本研究首先证实了小鼠脾脏中存在Ter细胞，并且发现发病高峰期CIA小鼠脾脏中Ter细胞比例较naïve小鼠明显升高，提示Ter细胞可能参与CIA发展。接下来的实验结果显示，发病高峰期CIA小鼠脾脏Ter细胞比例与CD4+T、Th1、Th17、GC-B细胞比例均呈强负相关，与B10细胞比例呈强正相关。而研究表明，Th1、Th17、GC-B细胞在RA中发挥致病作用[9-10]，B10细胞在RA中发挥保护作用[11]，提示Ter细胞在CIA中可能具有保护作用。随着疾病进展，发病晚期CIA小鼠脾脏Ter细胞比例明显降低，进一步提示Ter细胞在CIA中可能作为一种保护性细胞发挥作用。

Ter细胞在RA中发挥保护作用的具体机制仍需进一步研究确认。在体外通过Ter细胞与naïve T细胞共培养，观察其对T细胞分化的影响；通过Ter细胞与不同T、B细胞亚群共培养，观察其对不同T、B细胞亚群增殖的作用。在体内通过过继转移Ter细胞到CIA小鼠体内，观察其对CIA发展的加重或减轻情况。通过以上研究将进一步明确Ter细胞在RA发病中的作用。

Frequencys of Ter cells in the spleen of naïve and CIA mice at different stages. Ter cells were decreased markbly in CIA mice at late stage compared with peak stage.图4 CIA不同发病阶段Ter细胞的动态变化(n=6)Figure 4 Dynamic changes of Ter cells in different stages of CIA (n=6)

Han等[7]研究发现，在荷瘤小鼠中Ter细胞主要在脾脏发生异常扩增，参与疾病进展。RA的主要受累部位是关节和滑膜组织，Ter细胞是否在此部位异常聚集尚不清楚。我们目前正在进行RA患者滑膜组织中Ter细胞的数量及功能的研究；此外，CIA小鼠关节滑膜组织中Ter细胞的特征及功能也是我们未来的研究内容之一。

Ter细胞通过分泌artemin促进肝癌的进展，但Ter细胞在CIA中是通过artemin还是其他途径发挥作用目前仍不清楚。研究表明，artemin在多种肿瘤中表达上调，促进肿瘤进展[12-14]，但关于其在RA中的表达情况及作用仍未见报道，值得进一步研究。

综上所述，本研究发现成红细胞样Ter细胞在发病高峰期CIA小鼠脾脏中明显扩增，并且与关节评分及Th1、Th17、GC-B细胞比例均呈负相关，与B10细胞比例呈正相关，晚期CIA小鼠脾脏Ter细胞比例较高峰期明显降低，提示Ter细胞参与RA发病并且可能发挥保护作用，表明红系细胞可能参与RA的发病。后续研究中我们将进一步完善红系细胞对RA发病作用的研究，以期深入理解RA的发病机制，并为RA的治疗提供新的靶点。