半乳糖介导姜黄素牛血清白蛋白纳米粒的制备及质量评价*

张云，林毅鸿，叶扬扬，艾凤伟

(徐州医科大学药学院，徐州 221004)

姜黄素(curcumin)是从姜科植物郁金、莪术、姜黄等中药根茎中提取的一种小分子多酚类物质，具有抗肿瘤、抗突变、抗炎、抗氧化、抗病毒等药理活性[1-5]，且抗癌谱广、毒副作用低、不良反应小[6]。但由于姜黄素水溶性差，易被氧化降解，体内吸收困难，生物半衰期短，从而限制其在临床上的应用[7-8]。以高分子材料包裹疏水药物形成载药纳米粒，可提高装载药物的水溶性、稳定性和生物利用度，改善药物性质，达到缓释、靶向给药的目的，增加疗效，降低毒副作用等[9-11]。

白蛋白是一种内源性生物大分子材料，具有无毒性、生物可降解性、无免疫原性及在生物体内可代谢为无害的代谢产物等特点[12]。白蛋白纳米载体材料主要有牛血白蛋白(bovine serum albumin，BSA)、卵白蛋白(ovalbumin，OVA)及人血白蛋白(human serum albumin，HSA)等。其中BSA来源丰富、价格低廉且易于纯化等被广泛用于制备白蛋白纳米载药系统。BSA分子中含有的氨基和羧基等功能基团可采用特定的配体对白蛋白纳米粒表面进行修饰，半乳糖修饰的牛血清白蛋白(Gal-BSA)可实现荷载药物肝靶向[13]。笔者在本研究通过BSA结构中氨基和乳糖酸结构中羧基进行酰胺化反应合成Gal-BSA，以姜黄素为模型药物，Gal-BSA为载体材料，采用去溶剂化法制备半乳糖修饰的姜黄素白蛋白纳米粒(Gal-BSA NPs)，并考察纳米粒的形态、粒径分布、Zeta电位、包封率、载药量、体外释放等。报道如下。

1 仪器与试药

1.1仪器 EL104电子分析天平(梅特勒-托利多仪器有限公司，感量：0.1 mg)，FTIR-8400s傅立叶红外光谱仪(日本岛津公司)，PSS 380ZLS激光纳米粒度/电位仪(美国Particle Size Sytem公司)，透射电子显微镜(H-600，日本日立公司)，UV-2450紫外分光光度仪(日本岛津公司)，KQ-500型超声波清洗器(昆山市超声仪有限公司)，SHZ-B旋转气浴恒温振荡器(金坛市金分仪器有限责任公司)，FEI Tecnai G2T12透射电镜仪(美国FEI公司)，25L冷冻干燥机(美国LABCONCO公司)，85-1恒温磁力搅拌器(国华仪器公司)，TGL-16C高速离心机(上海安亭科学仪器厂)，透析袋(截留相对分子质量为2 000和12 000)。

1.2试药 姜黄素对照品(中国食品药品检定研究院，含量>99%，批号：150324)，姜黄素原料(郑州荔诺生物制品有限公司，含量>98%，批号：20140912)，牛血清白蛋白(上海国药试剂公司，含量>96%，批号：20150322)，乳糖酸(上海国药试剂公司，含量≥98.0%，批号：20150218)，N-羟基琥珀酰亚胺(NHS，上海国药试剂公司，含量97.0%～102.0%，批号：20150127)，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳酰二亚胺(EDC，上海国药试剂公司，含量≥99.0%，批号：20150106)，2-吗啉乙磺酸(MES，阿拉丁，含量≥99%，批号：1406003)，2，4，6-三硝基苯磺酸(Sigma公司，含量5%，批号：1001910376)，碳酸钠(上海国药试剂公司，含量≥99.8%，批号：20090102)，磷酸二氢钾(上海国药试剂公司，含量≥99.5%，批号：20070405)，磷酸氢二钠(上海国药试剂公司，含量≥99%，批号：20060103)，乙二胺四乙酸二钠(上海国药试剂公司，含量≥99%，批号：20110312)，聚山梨酯80(上海国药试剂公司，含量>99%，批号：20100518)无水乙醇(上海国药试剂公司，含量≥99%，批号：20150827)。

2 方法与结果

2.1Gal-BSA的合成 将乳糖酸适量(220 mg)溶解于MES溶液10 mL中，用0.1 mol·L-1氢氧化钠溶液调pH值至5。加入EDC 220 mg和NHS 110 mg，活化反应30 min。然后用0.1 mol·L-1氢氧化钠溶液调pH值至8，将BSA160 mg加入上述溶液，500 r·min-1搅拌反应48 h，让乳糖酸交联到白蛋白分子表面。所得溶液在透析袋(截留相对分子质量12 000)中透析3 d，每天换水3次，冷冻干燥得Gal-BSA。

2.2Gal-BSA的红外表征 取适量的Gal-BSA、BSA及乳糖酸样品，分别与溴化钾(KBr)粉末经混匀、研磨、压片。FTIR-8400S测定各样品的红外光谱。见图1。如图1a所示，BSA在约1647 cm-1及1541 cm-1处吸收峰分别为酰胺I、II的特征峰；图1 b为乳糖酸的FTIR谱图，其中约1743 cm-1处为羰基的吸收峰，约3355 cm-1处为羧基氢的吸收峰；图1 c为Gal-BSA的FTIR谱图，其中约1647 cm-1及1541 cm-1处吸收峰相比BSA明显变强变宽，说明产物中酰胺基团数目的增加，证实目标产物Gal-BSA的生成。

图1 BSA(a)、乳糖酸(b)、Gal-BSA(c) 的红外图谱

Fig.1InfraredspectrumofBSA(a)，Gal(b)，Gal-BSA(c)

2.3Gal-BSA NPs的制备 采用去溶剂法[14]制备BSA NPs，称取BSA40 mg溶于10 mmol·L-1氯化钠溶液2 mL，0.1 mol·L-1氢氧化钠溶液调节pH值至8～9，取适量的姜黄素溶于乙醇1 mL，以0.7～1.0 mL·min-1在磁力搅拌500～600 r·min-1下滴加，按试验设计量滴加剩余乙醇，后加入8%戊二醛60 μL，交联搅拌24 h，即得黄色BSA NPs的乳状液。

Gal-BSA NPs的制备与BSA NPs制备相似，取GAL-BSA40 mg溶于10 mmol·L-1氯化钠溶液2 mL，0.1 mol·L-1氢氧化钠溶液调节pH值至8～9，取适量的姜黄素溶于乙醇1 mL，以0.7～1.0 mL·min-1在磁力搅拌500～600 r·min-1下滴加，按试验设计量滴加剩余乙醇，后加入8%戊二醛60 μL，交联搅拌24 h，即得黄色的Gal-BSA NPs乳状液。

2.4包封率和载药量的测定

2.4.1姜黄素紫外标准曲线的建立 精密称取姜黄素对照品5 mg，乙醇溶解并定容到50 mL量瓶中，得100 mg·L-1的储备液，分别吸取0.05，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8 mL的储备液置于10 mL量瓶中，乙醇定容，配制浓度为0.5，1，2，4，6，8 mg·L-1的标准溶液，在波长426 nm处测定吸光度(A值)，以A值对姜黄素浓度(C)进行线性回归，得回归方程：A=0.1474C+0.0143。

2.4.2Gal-BSA NPs包封率和载药量的测定 精密移取一定量的Gal-BSA NPs胶体溶液，在12 000 r·min-1下超速离心15 min，精密移取上清液0.5 mL，用乙醇定容至10 mL量瓶，于波长426 nm处测定A值，计算未包封姜黄素的量(WS)。另精密吸取Gal-BSA NPs胶体溶液0.5 mL，用乙醇溶解载药纳米粒定容至50 mL量瓶，波长426 nm处测定A值，计算胶体溶液中姜黄素的总量(WT)。

包封率(entrapment efficiency，EE)、载药量(drug loading，DL)计算公式如下：EE(%)=(WT-WS)/WT×100%；DL(%)=(WT-WS)/WZ×100%；其中，WT为药物总量，WS为未包封的药物总量，WZ为载体材料重量。

2.5Gal-BSA NPs制备工艺优化 为了更好地优化Gal-BSA NPs的制备工艺，考察Gal-BSA浓度、乙醇滴加体积、pH值等影响因素，见表1。结果如下：控制Gal-BSA浓度和乙醇体积不变，Gal-BSA溶液的pH值为6～8时，Gal-BSA NPs的粒径变小，包封率无明显变化；控制Gal-BSA溶液的pH值和乙醇体积，Gal-BSA浓度为15～40 mg·mL-1时，Gal-BSA NPs的粒径变大，包封率变大；控制Gal-BSA浓度和pH值，当乙醇的滴加体积为5～10 mL时，Gal-BSA NPs的粒径变大，包封率无明显变化；综合考虑最小粒径和最大包封率的Gal-BSA NPs优化制备工艺为：Gal-BSA浓度为30 mg·mL-1、乙醇滴加体积为5 mL、Gal-BSA的pH值为8。

表1 Gal-BSA NPs的制备影响因素实验结果

样品数pH值BSA浓度/(mg·mL-1)乙醇体积/mL 粒径/nm包封率/%16205聚集—27205286.3±103.162.738205246.3±76.964.148405386.0±41.779.458155213.9±76.658.168305267.1±78.378.278208304.3±114.158.9882010370.9±179.269.5

2.6三硝基苯磺酸(TNBS)显色法测Gal-BSANPs表面氨基修饰度 BSA纳米颗粒2 mL高速离心后，重新分散在0.1 mol·L-1碳酸氢钠盐缓冲液(pH 值8.5)2 mL中，形成浓度约为0.5 mg·mL-1溶液，移取分散液2 mL，加入0.01%的TNBS水溶液1 mL，混合溶液在37 ℃下500 r·min-1反应2 h，12 000 r·min-1离心20 min，取上清液用分光光度计在波长345 nm处测定未反应的TNBS。

乳糖酸修饰的BSA纳米颗粒2 mL，高速离心后重新分散0.1 mol·L-1碳酸氢钠盐缓冲液(pH 值8.5)2 mL中。游离氨基修饰的BSA纳米颗粒含量用上述TNBS方法进行测定。通过对半乳糖化后所得到的量与原来游离氨基的量的比较，半乳糖化过程的效率通过半乳糖化的氨基基团的比例计算。

无乳糖酸修饰的BSA用TNBS显色法测得的A值为0.630，经乳糖酸修饰的BSA表面氨基所测得的A值为0.540，空白水溶液测得A值为0.145，即耦联于BSA纳米粒表面的乳糖酸密度为18.6%。

2.7Gal-BSA NPs外观形态与粒径分布 将纳米粒悬液滴加至载有碳膜的铜网上，滤纸吸干液体，室温下自然干燥，透射电镜观察其形态，结果见图2。可见纳米粒为边缘光滑、规整的球形粒子。

图2 Gal-BSA NPs透射电镜、粒径分布及电位

Fig.2TEMimage,particlesizedistributionandzetapotentialofGal-BSANPs

采用NicompTM380/ZLS型电势及粒度测定仪测定Gal-BSA NPs的粒径和Zeta电势。粒径测定参数如下：He-Ne激光(波长635 nm)，折光率和黏度分别为n=1.333和η=0.933 cp，测定温度23 ℃。Zeta电势测定参数如下：He-Ne激光(波长635 nm)，散射角θ=14°，测定温度23 ℃，结果粒径分布(267.1±78.3)nm，Zeta电位在-42.51 mV。

2.8体外释放度的研究 采用动态透析法[15-17]考察载药纳米粒的缓释性能。称取适量纳米粒(含姜黄素约1.5 mg)重新分散在含1%聚山梨酯80的PBS缓冲液(pH值5.9)10 mL中，精密移取溶液7 mL，装入经过处理的透析袋(截留相对分子质量12 000)中，两端用透析袋夹紧，置于含1%聚山梨酯80的PBS缓冲液(pH值5.9)200 mL中，恒温摇床上震荡，控制温度(37.0±0.5)℃，转速80～100 r·min-1，分别于0.25，0.5，1，3，6，9，12，24，36，48 h，取释放液4 mL，紫外分光光度法测定姜黄素的含量，并迅速补充含1%聚山梨酯80的PBS缓冲液(pH值5.9)4 mL。样品以含1%聚山梨酯80的PBS缓冲液(pH值5.9)为空白对照，波长426 nm处测定吸光度计算姜黄素含量。取3次实验的平均值，以释药量对时间作图，绘制载药纳米粒的释放曲线。结果见图3。由图3知，Cur原料药在释放介质中释放较快，8 h的释放量近100%；而Gal-BSA NPs在 8 h释药量为20%，在48 h释药量>80%，具有明显缓释特征。

图3 姜黄素与Gal-BSA NPs体外释药曲线

Fig.3InvitrodrugreleasecurveofCurandGal-BSANPs

2.9Gal-BSA NPs 体外释药模型拟合 分别按零级、一级、Higuchi方程对姜黄素纳米粒体外释药行为进行拟合，得到拟合方程及相关系数，见表2。相关系数越大，拟合度越好，零级方程表示药物恒量释放即控释释放，一级方程表示恒速释放，Higuchi方程常用来衡量制剂的缓释性能[18]。由表2可见零级方程拟合的相关系数为0.952 3，一级方程拟合的相关系数为0.845 3，Higuchi方程的相关系数为0.8928，可以得出姜黄素纳米粒的体外释放更符合零级方程的描述，主要为控释释放。

表2 体外释药模型拟合结果

Tab.2Fittingresultsofinvitrodrugreleasemodel

拟合类型拟合方程相关系数(R2)零级方程Q=0.016 6t+0.083 60.952 3一级方程ln(1-Q)=-0.049 7t-0.055 960.845 3Higuchi方程Q=0.1118t1/2+0.020 10.892 8

3 讨论

本研究以姜黄素作为模型药物，选择半乳糖修饰的牛血清白蛋白作为载体材料，采用去溶剂法制备姜黄素半乳糖化白蛋白纳米粒，单因素考察优化处方工艺。本实验制备的纳米粒具有良好的外观形态、粒径分布，提高荷载药物稳定性和溶解度，延长药物释放速率。

制备工艺优化实验中主要以纳米粒的外观形态、粒径分布和包封率为主要考察指标。选择去溶剂法制备纳米粒，考察载体浓度、乙醇滴加体积、pH值等影响因素，此外，还考察了乙酸乙酯、丙酮等去溶剂对纳米粒形成的影响，最后选择乙醇作为最终的去溶剂，体外溶出实验中，由于姜黄素在水中的溶解度较低，为了模拟制剂在体内的释放行为，本实验以含1%聚山梨酯80的PBS缓冲液(pH 值5.91)为释放介质，符合漏槽条件，同时姜黄素在该实验条件下稳定性较好。