意大利牛舌草提取物抗炎镇咳与体外抑菌作用*

徐晓琴，陈良，张娟，孙宇，卿德刚，倪慧

(1.新疆维吾尔自治区中药民族药研究所，乌鲁木齐 830002；2.新疆医科大学附属中医医院，乌鲁木齐 830000)

意大利牛舌草(AnchusaitalicaRetz.)又名牛舌草[1]“高孜万”[2]，源于紫草科牛舌草属植物，主要分布于地中海和热带地区[3]，为维吾尔医临床常用药，收载于《中华人民共和国卫生部药品标准》维药分册中，全草入药，具有生湿生热、润燥消炎、止咳平喘等功效，广泛用于心血管疾病与呼吸系统疾病的治疗，如肺炎、高血压、结核病、寒性咳嗽、感冒等[4]，是维吾尔医经典复方不可缺少的主药之一[5]。意大利牛舌草含有挥发油、黄酮类、三萜类、酚类和生物碱类等多种成分[6]，现代药理学研究证实其具有抗肿瘤、抗氧化、抗病毒、中枢神经系统作用、内分泌作用以及保护心血管等药理活性[5]，但是，在抗炎、镇咳、体外抑菌等方面的研究较少，本课题组基于意大利牛舌草的临床应用，对不同提取物展开活性评价，筛选其有效部位，为阐明意大利牛舌草抗炎、镇咳的药理作用及发挥药效的物质基础提供科学参考。

1 材料与方法

1.1实验动物 SD大鼠，无特定病原体(SPF)级，体质量150～180 g，110只，雄性；昆明种小鼠，SPF级，18～22 g，100只，雌雄各半，购自新疆实验动物研究中心。实验动物生产许可证号：SYXK(新)2016-0007。在温度为20～24 ℃、相对湿度为40%～60%、12 h光照交替的环境中饲养，自由摄食饮水。

1.2仪器 Mettler Toledo AB265-S电子分析天平(瑞士梅特勒-托利多公司，感量：0.1 mg)；UPT-I-5T优普超纯水仪(成都纯化科技有限公司)；YLS-8A多功能诱咳引喘仪(济南益延科技有限公司)；BSC-1300II A/ B3生物安全柜(上海博讯实业有限公司)；SPX-250B-Z生化培养箱(上海博讯实业有限公司)；KXQ.SG46.280高压灭菌锅(上海佳腾实验设备有限公司)；JM300/0.1电子天平(余姚纪铭称重校验设备有限公司，感量：0.1 mg)。

1.3材料 意大利牛舌草(批号：15120405，新疆奇康哈博中维药饮片有限公司，经新疆医科大学李永和教授鉴定，符合维吾尔药地方标准要求)；意大利牛舌草提取物(实验室自制，含芦丁0.52%)；角叉菜胶(Sigma公司，25 g，批号：SLBR0530V)；醋酸地塞米松片(天津药业集团新郑股份有限公司，批号：141014，规格：每片0.75 mg)；急支糖浆(太极集团重庆涪陵制药厂有限公司，规格：200 mL)；左氧氟沙星(武汉精细化工，批号：1502102)；营养肉汤培养基(青岛日水生物有限责任公司，批号：20150204)；营养琼脂培养基(青岛日水生物有限责任公司，批号：20160601)；二甲亚砜(SIGMA-VETEC公司，批号：WXDB2507V)。

菌株：大肠埃希菌(ATCC25922)；铜绿假单胞菌(ATCC27853)；金黄色葡萄球菌(ATCC25923)；白念珠菌[CMCC(F)98001]；枯草芽孢杆菌(CMCC63501)，以上菌株购自新疆维吾尔自治区药品检验所。

1.4意大利牛舌草提取物的制备 取干燥的意大利牛舌草8.0 kg，粉碎成粗粉，以25倍量体积分数为70%乙醇溶液加热回流提取1.5 h，提取2次，滤过，收集合并提取液，低温浓缩至完全无醇味，取适量浓缩干燥得到乙醇粗提物(提取率17.37%)；剩余药液分批取适量，依次以石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇溶剂萃取(其提取率分别为0.50%，0.48%，0.74%，3.88%)，收集各部位萃取液及水溶液减压回收溶剂，干燥得到不同萃取部位浸膏，其中乙酸乙酯、正丁醇、水溶物中芦丁含量分别为0.32%，1.57%，0.17%。

1.5不同提取物抗炎实验 采用大鼠足趾肿胀急性炎症模型[7-8]，将SD大鼠按照随机数字表分为11组，每组10只，分别为空白对照组、模型对照组、地塞米松组(醋酸地塞米松5 mg·kg-1)，以及乙醇粗提物、乙酸乙酯提取物、正丁醇提取物、水溶物的大、小剂量组(按生药量计为2.52，0.63 g·kg-1)，按10 mL·kg-1容积每日灌胃1次，空白对照组给予等量0.9%氯化钠溶液，连续给药7 d，末次给药1 h后用千分尺测定每只大鼠右后足趾厚度，然后在右后脚跖皮下注射1%角叉菜胶溶液0.1 mL，空白对照组注射等容积0.9%氯化钠溶液，分别于注射后0.5，1，2，4，6 h测量大鼠右后足趾厚度，按下式计算足趾肿胀度(mm)。

肿胀度(mm)=致炎后足趾厚度-致炎前足趾厚度。

1.6不同提取物镇咳实验 取咳嗽敏感小鼠按照随机数字表分成10组[9-10]，每组10只，分别为空白对照组(0.9%氯化钠溶液，30 mL·kg-1)，急支糖浆组(急支糖浆，13 g·kg-1)，以及乙醇粗提物、乙酸乙酯提取物、正丁醇提取物、水溶物大、小剂量组(按生药量计为3.04，0.90 g·kg-1)，每天灌胃给药1次，连续5 d，灌胃体积均为0.2 mL·(10 g)-1，第5天给药1 h后，将小鼠逐一放入诱咳引喘仪的密闭干燥笼具内，恒压喷入体积分数为25%浓氨水气雾，喷雾4 s引咳，观察记录咳嗽潜伏期及2 min内咳嗽次数，比较不同提取物的镇咳作用。咳嗽标准：腹肌收缩，同时张大嘴，有时有咳声，若潜伏期<1 min，且在1 min内出现3次以上典型咳嗽者为敏感动物，否则淘汰。

1.7不同提取物体外抑菌实验

1.7.1菌悬液的配置 取检测菌冻存液，37 ℃复苏，取冻存液10 μL加入营养肉汤培养基5 mL中，37 ℃摇床扩大培养12 h，经平板分离后用无菌接种环挑选单菌落，加入营养肉汤培养基50 mL，培养16 h，麦氏比浊法确定菌液浓度至0.5麦氏标准液。

1.7.2药物配置 称取4种提取物干粉各2.56 g，分别溶于营养肉汤10 mL中，乙酸乙酯提取物溶于含4%二甲亚砜的营养肉汤培养基10 mL中，搅拌混匀，115 ℃，30 min灭菌。按两倍梯度稀释后并按1：1与含菌液培养基混合，配置左氧氟沙星浓度为128，64，32，16，8，4，2，1和0.5 mg·mL-1的溶液。

1.7.3左氧氟沙星(阳性药)配置 按两倍梯度稀释法，配置左氧氟沙星浓度为128，64，32，16，8，4，2，1和0.5 μg·mL-1的溶液。

1.7.4体外抑菌实验 采用试管稀释法，取配制好的浓度药液加入试管每管3 mL，每管加待测菌液3 mL，37 ℃培养箱培养24 h。结果判定以肉眼观察，以试管中无细菌生长者药物最低浓度为该实验菌最小抑菌浓度(MIC)，如药物高浓度组颜色较深无法观测时，取药物前3个稀释度做涂布观测；吸取未长菌试管培养液，每皿100 μL涂布于营养琼脂平板，续培养48 h后观察菌的生长情况，无菌生长平板所含的最低药物浓度即为最低杀菌浓度值(MBC)。

2 结果

2.1抗炎实验结果 与空白对照组比较，模型对照组大鼠足趾肿胀度显著增加(P<0.01)；与模型对照组比较，0.63，2.52 g·kg-1意大利牛舌草乙醇提取物组在致炎后2 h内各时间段抑制大鼠足趾肿胀程度显著(P<0.01)；2.52 g·kg-1乙酸乙酯与正丁醇组在致炎后的4 h各时间段内抑制大鼠足趾肿胀程度显著(P<0.01)，见表1。

2.2镇咳实验结果 在延长咳嗽潜伏期方面，与模型对照组比较，急支糖浆组、乙酸乙酯大剂量组，正丁醇大、小剂量组实验小鼠的咳嗽潜伏期均延长(P<0.05)；乙醇提取物大、小剂量组及正丁醇大剂量组的延长潜伏期作用与急支糖浆组差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)；在减少咳嗽次数方面，急支糖浆组，乙醇提取物大剂量组，乙酸乙酯及正丁醇大、小剂量组，水溶物大剂量组实验小鼠的咳嗽次数均减少，其中乙酸乙酯大剂量组与正丁醇大剂量组咳嗽次数较急支糖浆组明显减少(P<0.01)，见表2。

2.3体外抑菌实验结果 由平板计数验证的菌落数均在范围内，则工作液浓度约为106cfu·mL-1，符合营养肉汤稀释法前提条件，见表3。意大利牛舌草4种不同提取物对5种菌株的抑制能力不同。见表4。

表1 不同极性提取物对大鼠足趾肿胀度的影响

组别剂量/(g·kg-1)足趾肿胀度0.5 h1 h2 h4 h6 h空白对照组—1.68±0.38∗11.26±0.6∗11.01±0.30∗1∗20.32±0.32∗10.09±0.17∗1模型对照组—2.55±0.25∗32.40±0.34∗32.37±0.31∗31.35±0.27∗30.47±0.29∗2地塞米松组51.27±0.41∗11.52±0.41∗11.30±0.12∗10.46±0.20∗10.12±0.22∗4乙醇 小剂量组0.631.57±0.59∗11.89±0.71∗41.91±0.42∗4∗31.05±0.64∗30.46±0.59∗2 大剂量组2.521.36±0.32∗11.76±0.40∗11.68±0.56∗10.86±0.53∗4∗20.32±0.34乙酸乙酯 小剂量组0.632.14±0.40∗31.95±0.61∗4∗21.91±0.64∗4∗31.22±0.55∗30.31±0.28 大剂量组2.521.80±0.79∗1∗21.53±0.13∗11.68±0.42∗10.94±0.60∗1∗20.18±0.20∗4正丁醇 小剂量组0.631.96±0.64∗1∗32.15±0.57∗32.03±0.71∗31.14±0.46∗30.18±0.24∗4 大剂量组2.521.68±0.43∗11.74±0.27∗11.68±0.25∗1∗20.95±0.31∗1∗20.14±0.19∗4水溶物 小剂量组0.631.70±0.33∗12.10±0.44∗32.13±0.27∗31.50±0.51∗30.52±0.34∗3 大剂量组2.521.85±0.54∗1∗32.07±0.35∗21.98±0.41∗4∗31.24±0.43∗1∗20.24±0.21

与模型对照组同一时间点比较，*1P<0.01，*4P<0.05；与地塞米松组同一时间点比较，*2P<0.05，*3P<0.01

Compared with model control group at the same time point,*1P<0.01，*4P<0.05; Compared with dexamethasone group at the same time point,*2P<0.05,*3P<0.01

表2 各组小鼠对浓氨水致咳嗽反应

组别剂量/(g·kg-1)咳嗽潜伏期/s2 min咳嗽次数模型对照组-30.87±6.44∗145.35±10.04∗1急支糖浆组1340.47±2.29∗236.77±9.60∗2乙醇 小剂量组0.9027.33±7.49∗337.15±8.92 大剂量组3.0429.83±3.61∗137.03±9.35∗2乙酸乙酯 小剂量组0.9032.97±12.9430.87±6.67∗4 大剂量组3.0441.74±9.15∗221.93±5.46∗3∗4正丁醇 小剂量组0.9041.42±14.23∗232.37±10.15∗4 大剂量组3.0451.95±12.62∗1∗424.22±7.02∗3∗4水溶物 小剂量组0.9032.90±11.4839.00±10.43 大剂量组3.0439.47±10.5336.4±6.69∗2

与急支糖浆组比较，*1P<0.05，*3P<0.01；与模型对照组比较，*2P<0.05，*4P<0.01

Compared withjizhisyrup group,*1P<0.05，*3P<0.01; Compared with model control group,*2P<0.05，*4P<0.01

3 讨论

本实验采用经典的角叉菜胶致大鼠足趾肿胀模型评价意大利牛舌草各提取部位的抗炎药理活性。在模型建立过程中，模型对照组大鼠足趾肿胀度较空白对照组显著增加，表明大鼠足趾肿胀模型造模成功，致炎后大鼠足趾发生炎症，肿胀度随时间发生相应的变化。致炎0.5 h后，空白对照组与模型对照组肿胀度值达到高峰，0.5～2 h内，肿胀度值变化较小，而在4 h后两组的肿胀度值均开始回落，空白对照组在6 h后肿胀逐渐恢复正常，模型对照组值在6 h后回落明显，考虑与角叉菜胶所致机体的急性炎症反应有关，此结果与国内相关报道接近[12]。

本研究显示，意大利牛舌草乙醇提取部位(0.63，2.52 g·kg-1)在致炎后2 h抑制大鼠足趾肿胀程度显著(P<0.01)，2.52 g·kg-1剂量组在致炎4 h内抑制炎症作用与醋酸地塞米松组作用相当，正丁醇部位与乙醇部位的抑制炎症效果差异无统计学意义，提示乙醇粗提取部位及正丁醇部位具有抗炎活性；小鼠镇咳实验反应，乙醇提取物组(3.04，0.90 g·kg-1)与正丁醇部位组(3.04 g·kg-1)延长小鼠咳嗽潜伏期作用与急支糖浆组作用相当(P<0.05或P<0.01)，并且乙醇提取部位、正丁醇部位3.04 g·kg-1剂量组咳嗽次数明显减少(P<0.05)，此结果提示意大利牛舌草乙醇提取部位、正丁醇部位均具有镇咳作用；二倍试管稀释法筛选不同提取物的抑菌活性实验显示，4种意大利牛舌草提取物分别对枯草芽孢杆菌具有抑菌活性，其中乙酸乙酯部位与水溶部位的抑制水平较其他部位明显。

表3 菌液稀释液浓度验证结果

表4 牛舌草提取物对5种菌株MIC和MBC结果

Tab.4MICandMBCofextractsofAnchusaitalicaRetz.onfivestrainsmg·mL-1

组别大肠埃希菌MICMBC金黄色葡萄球菌MICMBC枯草芽孢杆菌MICMBC铜绿假单胞菌MICMBC白念珠菌MICMBC左氧氟沙星组0.5×10-30.5×10-30.5×10-30.5×10-30.5×10-31×10-31×10-34×10-30.5×10-32×10-3乙醇提取物组>128>12864>12832128>128>128>128>128乙酸乙酯提取物组>128>128>128>12843264>128>128>128正丁醇提取物组>128>128>128>128>128>128>128>12864>128水溶物组>128>128>128>12846464>128128>128

本研究表明，意大利牛舌草乙醇粗提物具有抗炎、镇咳的药理活性，其正丁醇部位的活性较其他部位明显，并且与乙醇粗提取物的作用相当，在有效物质提取富集方面，正丁醇部位的提取率均高于其他极性部位，提示意大利牛舌草提取物在抗炎、镇咳方面显现出药理活性，值得深入研究。