基于整合药理学平台天麻治疗头痛的作用机制*

周荣荣，李培硕，关伟，王丽萍，李彦文，李志勇

(1.山西中医药大学基础医学院，晋中 030600；2.吉林省镇赉县人民医院，白城 030024；3.中国中医科学院中医药信息研究所，北京 100700；4.中央民族大学药学院，北京 100081)

有关研究表明，原发性头痛是卒中的危险因素[1]，偏头痛可增加全脑卒中、缺血性卒中的风险[2]。近年来，头痛的患病率升高，已引起全球性重视。据调查，偏头痛已上升为2013年全球疾病负担(Global Burden of Disease，GBD)的第6位[3]，在全世界致残疾病的第3位[4]；当前头痛主要依靠药物和预防性治疗，如阿片类药物或静脉注射氯胺酮等治疗方法[5]，但治疗效果并不乐观，头痛的防治越来越成为亟待解决的问题。

头痛属中医学“头痛”“头风”范畴。《普济方》认为：“气血俱虚，风邪伤于阳经...，则令人头痛”；现代研究总结头痛多因感受外邪、肝火上扰、肝阳上亢、痰瘀阻络、风痰上扰、气血亏虚等所致[6]。天麻为兰科植物天麻(GastrodiaelataBl.)的干燥块茎，以“赤箭”之名始见于《神农本草经》，性味甘，平，归肝经；功效能息风止痉，平抑肝阳，祛风通络，天麻是治疗头痛肝阳上亢、痰阻经络证的基础药。如李东垣《脾胃论》言：“足太阴痰厥头痛......眼黑头眩，风虚内作，非天麻不能除”；《本草汇言》言天麻：“主头风，头痛，头晕虚眩......一切中风，风痰”。现代研究也表明天麻具有调节促进突触可塑性和神经修复、抑制神经细胞凋亡等作用[7]，但天麻治疗头痛的机制仍不十分明确。

中药整合药理学计算平台V1.0(http：//www.tcmip.cn/)是以中医药大数据为基础，通过人工智能、数据挖掘与网络药理学、分子生物学等学科结合的方法，一站式完成“中药-多成分-多靶点-疾病”之间网络关系计算，可有效预测中药的潜在药效、分子作用机制等[8]。笔者通过中药整合药理学平台，探究天麻有效化学成分及治疗头痛的分子机制，为天麻临床实验研究提供科学依据。

1 资料与方法

1.1资料来源 数据由中药整合药理学计算平台的中药材数据库、中药成分数据库、疾病/症状靶标数据库提供。与中药、疾病相关的靶标基因及相关生物信息资源来源于Drugbank，OMIM(Online Mendelian Inheritance in Man)，HPO(Human Phenotype Ontology)，GO(gene ontology)，TTD(Therapeutic Target Database)，KEGG( Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)等数据库。蛋白-蛋白相互作用信息(PPI)整合药理学平台镶嵌HAPPI，Reactome，OPHID，In Act，HPRD，PDZBase，MINT，DIP等数据库中蛋白-蛋白相互作用数据。3种拓扑结构特征值“连接度(degree)”“介度(betweenness)”“紧密度(closeness)”设定以确定中药矫正疾病失衡网络的候选靶标。通过GO和KEGG数据库，确定靶标基因、蛋白质分子功能、细胞内定位及其所参与的生物学反应和通路。

1.2研究步骤

1.2.1信息设定 登陆中药整合药理学平台，新建“天麻-头痛”任务，检索中药材数据库将“天麻”信息添加保存，得到21种化学成分；以“头痛”相关的英文名称“Headache”“Migraine”作为关键词进行检索，将检索结果保存得到头痛疾病相关的靶标。

1.2.2靶标预测 设置相似性分数0.8，整合药理学平台，通过化学成分二维结构(.mol或.sdf)相似性与美国食品药品管理局(food and drug administration，FDA)上市药物进行比对，以Tanimoto系数定义的相似度计量方法进行相似性打分，信息设定与相似性分数设置完成后，点击“确认”。

1.2.3一站式计算 平台智能进行“靶标预测、蛋白质-蛋白质互作(PPI)、网络构建、核心靶标(Core targets)的筛选、可视化等”一站式分析，生成报告。

1.2.4拓扑特征值 以“节点连接度”的 2倍中位数为卡值，选取中药靶标-疾病基因互作网络的核心节点；在此基础上，选取同时满足节点“连接度”“紧密度”“介度”中位数的节点，构建中药潜在靶标与疾病靶标之间相互作用的关键靶标网络。

2 结果

2.1天麻所含化学成分和药物靶标预测 天麻化学成分21种，主要有酚类、多糖类、氨基酸、甾醇类等多种化学成分，研究表明天麻素(gastrodin)、香草醇(vanillyl alcohol)、4-(4'-羟基苄氧基)苄基甲基醚(4-(4'-Hydroxybenzyloxy)benzyl methyl ether)、p-羟基苯甲醇(p-Hydroxybenzyl alcohol)、香草醛(vanillin)等是天麻的主要神经药理学活性成分[9]，尤其是天麻素已明确其在痉挛性疾病、头晕和头痛、神经损伤等方面有显著效果[10]；对天麻的化学成分进行靶标预测，相似性分数为0.8时，天麻的预测靶标数355个，其中天麻素预测靶标数71个、双(4-羟基苯基)乙醚预测靶标数68个、蔗糖预测靶标数83个、十六烷酸(棕榈酸)预测靶标数49个等。

2.2天麻预测靶标GO富集分析、KEGG通路富集分析 对天麻的预测靶标进行GO富集分析、KEGG通路富集分析，结果均差异有统计学意义(P<0.01)，得到GO富集分析结果486条和KEGG通路富集分析结果35条，发现天麻的预测靶标与柠檬酸循环(tricarboxylic acid cycle)、琥珀酸代谢过程(succinate metabolic process)、异柠檬酸代谢过程( isocitrate metabolic process)、琥珀酸脱氢酶活性(succinate dehydrogenase activity)等生物功能，功能定位在线粒体(mitochondrion)、succinate dehydrogenase complex(线粒体呼吸链复合物Ⅱ、琥珀酸脱氢酶复合体)等；发现天麻的预测靶标与柠檬酸循环(citrate cycle)、碳水化合物代谢(carbohydrate metabolism)、脂质代谢(lipid metabolism)、过氧化物酶体增殖物激活受体(peroxisome proliferator-activated receptors，PPAR)信号通路、2-氧代羧酸代谢(2-oxocarboxylic acid metabolism)脂肪酸代谢等生物代谢通路有关。

2.3天麻“药物-靶标-疾病”网络的核心节点(Hub)分析 通过整合药理学平台得到40个头痛相关的靶点，并利用蛋白-蛋白相互作用模块构建天麻潜在靶标与头痛靶标相互作用关系，平台设定同时满足大于节点“连接度”“介度”“紧密度”的中位数为卡值，选取关键核心靶标，并进行核心靶标的GO富集分析、KEGG通路富集分析，根据连接度值排名前100位的靶点信息绘制的核心靶标网络图(图1)。

图1 核心靶点网络

结果得到核心靶标信息118条，其中潜在药物靶标(putative drug target)9条，如GCK、ATP1A1、RPIA、ITPA、YWHAE、CPB1、RCVRN、LY96、PPARG，已知疾病靶标(known disease target)27条，如HTR2B、HTR1B、HTR1D、PIK3CA、HTR1A、HTR1F、ADORA2A、HRH4、IMPA1、ADORA1、HTR7、PIK3CB、CALCB等(表1)。

2.4关键靶标GO富集分析和KEGG通路富集分析 平台对天麻干预头痛的关键靶标分析，得到GO富集分析结果949条和KEGG通路富集分析结果137条。GO富集分析显示天麻参与生物功能主要定位在质膜(plasma membrane)、细胞质(cytosol)、神经递质、树突等，参与G-蛋白耦联5-羟色胺受体活性(G-protein coupled serotonin receptor activity)、血清素受体信号通路( serotonin receptor signaling pathway)、第二信使环核苷酸耦联的G-蛋白耦联受体信号通路(G-protein coupled receptor signaling pathway，coupled to cyclic nucleotide second messenger)、血清素结合(serotonin binding)、血小板活化(platelet activation)、肌醇磷酸代谢过程(inositol phosphate metabolic process)、磷脂酶C活性( phospholipase C activity)、蛋白激酶活性(protein kinase activity)、胞质内游离钙离子的释放(release of sequestered calcium ion into cytosol)、磷脂酶C活性的激活(activation of phospholipase C activity)等，见表2；KEGG通路分析预测天麻在关于神经系统(nervous system)、炎症递质调节色氨酸通道(inflammatory mediator regulation of TRP channels)、5-羟色胺能神经突触(Serotonergic synapse)、雌激素信号通路(estrogen signaling pathway)、Calcium signaling pathway(钙信号通路)、神经营养因子的信号转导通路(neurotrophin signaling pathway)、缝隙连接(gap junction)、信号通路(cGMP - PKG signaling pathway，cGMP PKG)、磷脂酰肌醇信号系统( phosphatidylinositol signaling system)、胆碱能突触(cholinergic synapse)、碳水化合物代谢(carbohydrate metabolism)、神经活性的配体-受体相互作用(neuroactive ligand-receptor interaction)等主要疾病靶标通路，见表3。

表1 天麻治疗头痛核心靶标表(排名前20位)

Tab.1CoretargetsofGastrodiarhizomaforthetreatmentofheadache(Top20)

种类核心靶标连接度紧密度介度已知疾病靶标HTR2B430.606 217 625.898 305 08 潜在药物靶标 GCK420.567 961 174.872 881 36已知疾病靶标HTR1B320.529 411 760.00E+00已知疾病靶标HTR1D320.529 411 760.101 694 92潜在药物靶标ATP1A1310.521.402 542 37已知疾病靶标PIK3CA310.522 321435.495 762 71已知疾病靶标HTR1A310.527 027 030.00E+00已知疾病靶标HTR1F310.527 027 031.398 305 08已知疾病靶标ADORA2A300.559 808 613.313 559 32已知疾病靶标HRH4280.430 147 063.220 338 98已知疾病靶标IMPA1270.455 252 923.436 440 68已知疾病靶标 ADORA1270.455 252 920.673 728 81已知疾病靶标 HTR7250.513 157 891.025 423 73已知疾病靶标CALCA210.473 684 212.118 644 07其他PLCB2200.517 699 120.419 491 53已知疾病靶标PIK3CD190.471 774 192.588 983 05已知疾病靶标PIK3CB190.434 944 241.694 915 25其他PLCB3190.508 695 651.326 271 19 已知疾病靶标 ALCB170.431 734 320.525 423 73

表2 天麻治疗头痛的GO生物功能表(排名前10位)

Tab.2BiologicalfunctionofGastrodiarhizomaforthetreatmentofheadache(Top10)

编号条目(术语)P值GO:0004993G-蛋白耦联5-羟色胺受体活性(G-protein 1.06E-18 coupled serotonin receptor activity)GO:0007210血清素受体信号通路(serotonin receptor 1.09E-16 signaling pathway)GO:0007187与环核苷酸第二信使耦联的G-蛋白耦联受体3.56E-15 信号通路(G-protein coupled receptor signaling pathway,coupled to cyclic nucleotide second messenger)GO:0005886质膜(plasma membrane)5.97E-15GO:0005829细胞质(cytosol)3.76E-12

表3 天麻治疗头痛的主要通路表(排名前10位)

Tab.3MainpathwaysofGastrodiarhizomaforthetreatmentofheadache(Top10)

编号条目(术语)P值#神经系统(nervous system)6.78E-20hsa04750炎症递质调节色氨酸通道(inflammatory 2.72E-18 mediator regulation of TRP channels)hsa047265-羟色胺能神经突触(serotonergic synapse)5.97E-17hsa04915雌激素信号通路(estrogen signaling pathway)1.88E-14hsa04020钙信号通路(calcium signaling pathway)7.80E-14

“#”代表大通路

“#” means the systematic pathway

2.5“中药-成分-关键药靶-通路”网络可视化图分析 按照核心靶标的KEGG通路P值前30位进行绘制的“中药-成分-关键药靶-通路”网络可视化图(图2)，可以观察到天麻的6种化学成分天麻素(TCMIP105357)、双(4-羟基苯基)醚-β-D-喃葡萄糖(TCMIP105353)、枸橼酸(TCMIP100469)、苍耳苷/β-谷甾醇3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(TCMIP100352)、蔗糖(TCMIP100350)、十六烷酸(TCMIP100276)和6个潜在的关键靶标GCK、ATP1A1、RPIA、YWHAE、LY96、PPARG关联密切，并参与神经系统(nervous system)、神经营养因子的信号转导通路( neurotrophin signaling pathway)、碳水化合物代谢( carbohydrate metabolism)、胃酸分泌( gastric acid secretion)、细胞生长与死亡(cell growth and death)、信号转导(signal transduction)、循环系统( circulatory system)、内分泌系统(endocrine system)等通路。

3 结束语

笔者通过整合药理学平台 V1.0预测天麻防治头痛的有效成分及其潜在作用靶点，从整体上探究天麻活性成分与疾病关键靶标的密切关系以及主要的生物功能通路过程。平台发现天麻素、双(4-羟基苯基)醚-β-D-喃葡萄糖、枸橼酸、苍耳苷/β-谷甾醇3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、十六烷酸等成分与头痛预测的核心靶标有高度相关性。天麻富含酚类物质和多糖，已证实天麻素和4-羟基苄基醇等酚类成分都有显著的神经保护、抗炎镇痛、抗氧化等作用[11-12]。27条“天麻-头痛”已知靶标中HTR2B、HTR1B、HTR1D、PIK3CA等具有很高的网络拓扑特征值，COROMINAS等[13]证明5-羟色胺受体2B (HTR2B)在有先兆偏头痛和无先兆偏头痛疾病均有不同的参与过程； YUCEL等[14]研究发现偏头痛患者表现为系统性5-羟色胺浓度降低和脑内5-羟色胺合成率的变化，5-HTR2A、5-HTR2C参与诱发头痛，5-HTR1A、5-HTR1B、5-HT1D受体能迅速缓解曲坦类药物导致的偏头痛和丛集性头痛；PIK3CA(磷脂酰肌醇3-激酶)是参与细胞增殖、G蛋白耦联受体的信号转导等方面的重要基因，参与癌症基因表达等，可能与胶质神经元肿瘤引起的头痛有关[15]。9个关于头痛的潜在药物靶标中葡萄糖激酶(glucokinase，GCK)、ATPA1的网络拓扑特征值相对较高，分别排在第2位和第5位，GCK是维持人体葡萄糖体内平衡的传感器[16]，平台显示GCK与Gastrodin、Bis(4-hydroxybenzyl)ether mono-β-D-glucopyranoside、sucrose密切相关，相关研究也表明天麻素有显著的降血糖作用，能调节脂代谢紊乱等[17]，推测天麻素药理作用与GCK有一定关系；ATP1A1(钠/钾转运的碱性磷酸酶亚基α-1)是通过对Na和K离子通过质膜进行电化学梯度建立和维护的膜蛋白，研究发现它与高血压病有关[18]；RPIA(5-磷酸糖异构酶A)也是相对网络拓扑特征值较高的潜在靶标，它主要参与戊糖磷酸途径，与脑白质病、周围神经疾病等有关[19]，此外还有YWHAE、LY96、PPARG等拓扑值相对较小的潜在药物靶标。

绿色：中药；紫色：成分；蓝色：关键靶标；红色：通路

生物活性成分和疾病靶标的鉴定与研究是中药研究的一个重要领域[20]，本研究基于中药整合药理学平台有效证实天麻活性化学成分，并预测出天麻防治头痛的潜在药物靶标及作用机制，但只考虑中药成分和疾病靶标与目标蛋白之间的相互作用，还不足以解释中医药对疾病基因表达更深层面的影响，还需要进一步的实验证明和探究。