显微图像法检测芪术玄参微粉粒度的试验

马 霞 ,郭振环 ,王长林 ,王秀君 ,刘永录 ,张国祖

(1.河南牧业经济学院,河南郑州450046 ;2.河南省康星药业股份有限公司,河南郑州 451464)

随着科技的发展与进步,颗粒的粒度分析方法得到了改进和发展,并在生产和科研中得到了广泛应用(如激光衍射法、显微图像法、筛分法等)。其中随着计算机的处理能力和摄影器件的分辨率的提高,基于图像处理的粒度检测技术已经取得较大的成果,这种检测技术具有检测快速、结果稳定、准确的优点[1]。显微图像粒度分析法作为一种绝对测量方法,也是颗粒度标准物质定值的主要方法之一[2]。

蔡光先等[3]将中药超微粉定义为粒度为系微米级的中药,是经细胞级微粉碎所获得的中药微粉。对中药粒度的检测《中国兽药典》中有筛分法[4],然而筛分法对小于200 目的干粉很难观察和测量[5],因此不适用于中药微粉粒度测定。

芪术玄参微粉是自拟组方并经专利设备(过筛同时分级)加工达到微米级的国家三类新兽药,为制定其粒度检测标准,本试验参照《中国药典》通心络胶囊中粒度检测方法[6],对300 目芪术玄参微粉采用不同分散介质、分散方式、比例及时间进行比较选择,建立了检测方法,并采用此方法检测了多批次芪术玄参微粉的粒径分布,建立了粒度控制标准。

1 材料与方法

1.1 试验材料 Winner99 型显微图像分析系统(包括电子显微镜、电脑带粒度测量软件、物镜测微尺),购自济南微纳科技有限公司;甘油、醋酸、乙醇,均为分析纯,购自天津市富宇精细化工有限公司;300 目芪术玄参微粉样品10 批。

1.2 试验方法 仪器校正(调整比例尺参数):将标准刻度尺置于显微镜载物台上,在100 倍(10 ×10)放大倍数下,调整焦距使其图像清晰;在标准刻度尺上拾取一定的距离即图像距离,读取标准刻度尺的微米数即实际长度,实际长度/图像距离即比例尺的数值。

测试过程:称取混匀样品适量,加入分散介质分散均匀后立即取1 滴置载玻片上,覆以盖玻片,显微镜下在100 倍显微镜下观察。

1.2.1 分散介质的选择 分别用无水乙醇、甘油醋酸试液、甘油∶无水乙醇(1∶2与2∶1)、水合氯醛作为分散介质对芪术玄参微粉进行分散,显微镜下观察颗粒分散效果及颗粒膨胀程度。

1.2.2 分散方式的选择 采用手动震荡分散与超声振荡器2 种方式对芪术玄参微粉分散相同时间,显微镜下观察其分散效果。

1.2.3 分散时间的选择 取0.010 g 芪术玄参微粉3 份,分别置10 mL 甘油醋酸试液中,超声5 min、10 min、15 min,显微镜下观察颗粒分散效果。

1.2.4 粉末称样量的选择 取0.003 g、0.005 g、0.008 g、0.010 g 的样品各2 份,分别加入至5 mL和10 mL 甘油醋酸试液中,超声10 min,显微镜下观察1 个视野下的颗粒数是否在100 个左右。

1.2.5 芪术玄参微粉10 批样的显微图像法粒度检测及标准制定 取芪术玄参微粉10 批样各0.005 g,分别加入至10 mL 甘油醋酸试液中,超声10 min,取出,摇匀,立即取1 滴置载玻片上,覆以盖玻片(22 mm×22 mm),同法制备5 片。在100 倍显微镜下,检视测量粒子长径,每片随机检视5 个视野,共计25 个视野,观察每个视野长径大于48 μm及75 μm 的粒子个数,进行数据统计并依据数据制定标准。

2 结果与分析

2.1 分散介质的选择 结果显示用水合氯醛作分散介质时,颗粒有所膨胀;用无水乙醇作分散介质时颗粒趋向缩小;甘油∶无水乙醇(2∶1)作为分散介质时,眼观样品易结块,分散不均匀;用甘油∶无水乙醇(1∶2)作为分散介质,颗粒也有所缩小。用甘油醋酸试液作为分散介质时样品分散均匀,且颗粒无膨胀现象,故最终选择甘油醋酸试液作为芪术玄参微粉显微检测的分散介质。

2.2 分散方式的选择 结果显示,采用手动震荡分散时,样品分散不均匀,而超声振荡器分散较均匀,故在显微检测时选择超声振荡器对样品进行分散。

2.3 分散时间的选择 结果显示,分散超过10 min的样品均分散较均匀,效果均较好,考虑检测效率故将超声分散时间定为10 min。

2.4 粉末称样量与分散介质体积的选择 如表1所示,分散介质为5 mL 时,称样量高于0.003 g 时视野下颗粒数较多,难以计数,即称样量需为0.003 g,此时称样量过小,误差较大,故确定分散介质体积为10 mL。

称样量为0.003 g 时,视野下颗粒数为60 个左右,称样量为0.005 g 时,视野下颗粒数为100 个左右,称样量大于0.008 g 时,视野下颗粒数均多于160 个,颗粒数较多。故最终确定称样量0.005 g,分散介质体积为10 mL。

表1 称样量与分散介质体积的选择

2.5 芪术玄参微粉10 批样的显微图像法粒度检测及标准制定 对10 批样进行显微粒度检测,结果显示,每批样大于48 μm 的平均颗粒数均未超过5个,平均值加减标准差为3.4 ±0.70,大于75 μm 的平均颗粒数均未超过2 个,平均值加减标准差为1.4±0.52。故确定300 目芪术玄参微粉的显微粒度检测标准为:在100 倍显微镜下,检视测量粒子直径(长径),每片随机检视5 个视野,共计25 个视野,平均每个视野直径(长径)大于48 μm 的颗粒个数不得超过5 个,大于75 μm 的颗粒个数不得超过2 个。

表2 芪术玄参微粉10批样品检测

3 讨论

显微镜法测试颗粒粒度分布时,以适当分散介质将样品分散后涂于载玻片上或直接涂于载玻片上置显微镜下观察,采用显微镜拍照法将大量颗粒试样照相,然后,根据所得的显微照片,进行颗粒粒度的分析统计。其优点是分辨率较高,不仅能观察到颗粒大小,而且能观察颗粒的微细形貌及结构,特别是对颗粒形状各异的微细物料粒度分析,无疑是一种较好的方法。缺点是操作复杂,人为因素干扰较大,但随着计算机图像处理技术的发展,基于图像处理的粒度检测将会应用于越来越多的领域[7],尤其适用于中药微粉粒度的检测。

粒度测量的关键技术在于样品的分散。对于分散介质的选择,既要考虑分散的均匀性,也要兼顾样品颗粒大小不受分散介质影响。本试验中采用水合氯醛作分散介质颗粒有所膨胀;用无水乙醇或甘油∶无水乙醇(1∶2)作分散介质时颗粒趋向缩小;甘油∶无水乙醇(2∶1)作为分散介质时,样品分散不均匀;用甘油醋酸试液作为分散介质时样品分散均匀,且无膨胀现象,故最终选择甘油醋酸试液作为芪术玄参微粉显微检测的分散介质。

考虑样品分散均匀度及视野中颗粒数的限制,分别对分散方式、分散时间及称样量与分散体积等又进行了考察,最终确定称样量为0.005 g 分散于10 mL 甘油醋酸试液中,超声10 min,在此条件下,芪术玄参微粉样品分散较均匀,100 倍显微镜下检视,每个视野下颗粒数约为100 个。

粒度检测标准的制定:对10 批300 目芪术玄参微粉采用所建立方法进行检测,结果显示,每批样大于48 μm 的平均颗粒数均未超过5 个,平均值为3.4 ±0.70;大于75 μm 的平均颗粒数均未超过2个,平均值为1.4 ±0.52。故确定300 目芪术玄参微粉的显微粒度检测标准为:在100 倍显微镜下,检视测量粒子长径,每片随机检视5 个视野,共计25个视野,平均每个视野长径大于48 μm 的颗粒个数不得超过5 个,大于75 μm 的颗粒个数不得超过2 个。