依那西普对糖尿病大鼠视网膜凋亡通路中Fas，TNF-α及caspase-8表达的影响

叶 琴，黄 焱，朱益华

随着糖尿病患者的不断增加，糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy，DR)已成为糖尿病常见的严重并发症。DR发病机制复杂，目前多项研究发现，多种细胞因子参与了DR的发病过程，如血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、白细胞介素-2(interleukin-2，IL-2)、肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-alpha，TNF-α)、IL-1β、干扰素γ(interferon-7，IFN-γ)等[1-3]。Fas，TNF-α及caspase-8是细胞凋亡信号通路的重要因子，共同作用致糖尿病视网膜神经节细胞凋亡。依那西普是一种细胞表面TNF受体的竞争性抑制剂，可以抑制TNF的生物活性，参与调节TNF及其他下游分子(细胞因子、粘附分子或蛋白酶)控制的生物反应。本研究通过建立糖尿病大鼠模型，观察依那西普对糖尿病大鼠视网膜中Fas，TNF-α及caspase-8表达的影响及依那西普对糖尿病大鼠视网膜渗漏量的影响，为临床治疗提供理论依据。

1 材料与方法

1.1动物 健康雄性SD大鼠60只，体质量(200±20)g，清洁级[福建医科大学动物中心，许可证号：No1610240014]，均饲养于标准化动物中心，自由饮水摄食。采取随机数字表法，将60只大鼠随机分为对照组、模型组、治疗组，每组20只大鼠。模型组、治疗组适应性喂养1周后禁食12 h，采用腹腔注射链脲佐菌素(streptozocin，STZ)溶液的方法建立DR模型，模型组和治疗组大鼠腹腔注射新鲜配置的1%STZ溶液(STZ+柠檬酸缓冲液)60 mg/kg[4-5]。糖尿病模型确立的标准：72 h后取大鼠尾静脉测血糖，血糖>16.7 mmol/L为糖尿病大鼠造模成功。DR模型建立后第3天开始，治疗组给予大腿前部皮下注射依那西普(浓度0.4 mg/kg)，每天1次，直至实验结束。

1.2Western-blot法测定Fas,TNF-α,caspase-8的表达 各组取12只大鼠，麻醉下摘取双眼眼球，去除眼前段，剥离视网膜组织，用精密天平称质量后，以0.05 mmol/L的冰冷磷酸缓冲液(pH=7.8，含0.01 mmol/L的EDTA)冰浴下制成10%的匀浆用作检测。冻存的视网膜组织加入裂解液(含5%蛋白酶抑制剂)，充分裂解后，12 000 r/min离心5 min，按蛋白∶上样缓冲液=4∶1的比例加入上样缓冲液，95 ℃水浴5 min后，10 000 r/min离心5 min，即得细胞总蛋白。4 ℃保存备用。上样后电泳，调节电压40 V，时间40 min，待溴酚蓝条带进入分离胶后调电压90 V，时间80 min。电泳至溴酚蓝跑到凝胶底部时终止电泳。转膜电压100 V转移1 h。转移成功后，把PVDF膜浸泡在封闭液中，置于摇床上，室温封闭2 h。加入一抗(Fas的浓度1∶800，TNF-α的浓度1∶2 000，caspase-8的浓度1∶1 000)，4 ℃孵育过夜。洗涤加入相应二抗(Fas,TNF-α,caspase-8的二抗均为1∶2 000)。置于摇床上，室温孵育2 h。以β-actin为内参，化学发光法显影，凝胶成像仪成像，凝胶分析系统观察拍照、分析。

1.3视网膜伊文思蓝(evans blue，EB)渗漏量测定 分别取各组8只大鼠水合氯醛腹腔注射麻醉后，参照文献[6-7]方法检测视网膜EB渗漏量，了解血视网膜屏障(blood retinal barrier，BRB)的破坏程度。用分光光度计测量样品在620 nm和740 nm波长的吸光度(OD)值。每个样品测3次，取平均值,建立EB染料浓度在甲酰胺中的标准曲线：

OD净值=OD620-OD740

2 结 果

2.1大鼠空腹血糖和体质量的变化 与对照组比较，造模后各个时间点模型组、治疗组血糖显著升高，而体质量则显著低于正常组，差别均有统计学意义(P<0.05,表1)；与模型组比较，造模后各个时间点治疗组体质量增加，差别有统计学意义(P<0.05)；与模型组比较，治疗组血糖无明显变化，差别无统计学意义(P>0.05，表2)。

表1 大鼠体质量的变化Tab 1 Changes in weight of rats in each group

表2 大鼠空腹血糖变化Tab 2 Changes in blood glucose of rats in each group

2.2Western-blot定量检测结果 对照组、模型组、治疗组的Fas，TNF-α及caspase-8表达量组间比较，差别具有统计学意义(Fas的F=6.726，P<0.01；TNF-α的F=12.695，P<0.01；caspase-8的F=25.039，P<0.01)。模型组、治疗组的表达量较对照组增强(P<0.01)，治疗组的表达量较模型组减少(P<0.01，图1)。

TNF-α:肿瘤坏死因子;与对照组比较，☆：P<0.05.图1 各组大鼠视网膜Fas，TNF-α及caspase-8的蛋白含量的相对表达量Fig 1 The relative protein expression of Fas,TNF-α and caspase-8 in rat retina

2.3视网膜EB渗漏量 EB浓度与净OD值之间呈高度直线相关:Y=0.070 2 X+0.012 5(r=0.996,P=0.001)；其中Y表示净OD值，X表示EB浓度。以此计算出各组样品OD值对应的EB质量浓度，用浓度乘以300 μL得出视网膜EB渗漏量(ng)。以视网膜干质量(mg)标化EB渗漏量(ng)，结果表示为ng/mg。对照组、模型组、治疗组的EB平均渗漏量分别为(2.43±0.24)，(7.93±0.31)及(4.87±0.24)ng/mg，EB平均渗漏量组间比较，差别有统计学意义(F=854.966，P<0.01)。组间两两比较，模型组的平均渗漏量较对照组明显升高；治疗组的平均渗漏量较模型组明显减少，差别均有统计学意义(P<0.01，图2)。

3 讨 论

通过给大鼠腹腔注射STZ，本研究成功建立糖尿病模型，模型组与治疗组大鼠的血糖全部达到糖尿病的建模要求，在第4，8，12周模型组与治疗组的空腹血糖均明显高于对照组。所有糖尿病大鼠均有多饮、多食、多尿及体质量减轻的症状，在第4，8，12周模型组与治疗组的体质量均明显低于对照组。

目前公认的有三条途径参加细胞凋亡，即线粒体途径、内质网途径和死亡受体途径，其中死亡受体途径是外在凋亡途径。近年来，死亡受体途径引起的凋亡，越来越受到研究者的重视。死亡受体众多，但其信号的转导通路却主要有3条：FAS/FASL途径、TNFR途径、TRAIL途径[8-9]。Fas是Ⅰ型跨膜糖蛋白，属于TNF受体超家族成员；Fas的天然配体(FasL)Ⅱ型跨膜糖蛋白，也属于TNF家族。

EB:伊文思蓝.EB平均渗漏量组间比较，△：P<0.01.图2 各组大鼠视网膜EB渗漏量的比较Fig 2 Compared with rat retina EB leakage in each group

caspase 家族是一类半胱氨酸蛋白酶，在细胞凋亡的过程中扮演重要角色。caspase 未被激活时以酶原形式存在(pro-caspase)，一旦被激活后就剪切成有活性的亚单位(cleaved caspase)。根据作用不同，分为起始 caspase 和效应 caspase 两个亚类[10]。其中，caspase-8 属于起始caspase，在Fas/TNF-α死亡受体介导的细胞凋亡中起重要作用。在各种细胞凋亡信号的刺激下，死亡受体活化导致起始酶caspase-8的激活，通过细胞内Fas等相关媒介蛋白调控，进一步激活其下游效应分子caspase-3和caspase-7，从而导致细胞凋亡的发生[11]。

本研究采用 Western-blot 检测大鼠视网膜死亡受体Fas，TNF-α及其下游的caspase-8，发现模型组和治疗组的Fas，TNF-α及caspase-8的蛋白表达水平均明显高于对照组，说明凋亡效应在糖尿病大鼠早期改变中起了较大作用。治疗组的Fas，TNF-α及caspase-8明显低于模型组，说明依那西普可以减少凋亡。Demircan等应用酶联免疫吸附方法检测DR患者血清及玻璃体中TNF-α含量，发现其血清及玻璃体中TNF-α含量均显著高于正常者[12]。本研究也发现TNF-α在DR中表达增加。

TNF-α引起DR发生发展的机制可能是由于高血糖环境下，视网膜代谢发生异常，导致视网膜毛细血管结构的破坏，造成视网膜缺血缺氧等损伤，并打破视网膜血管生长因子和抑制因子之间的平衡状态，使TNF-α等促血管生成因子增加，导致DR新生血管生成等一系列病变。依那西普是一种细胞表面TNF受体的竞争性抑制剂，抑制TNF的生物活性并阻断TNF通道的细胞反应。依那西普可能还参与调节由TNF诱导或调节的其他下游分子(细胞因子、粘附分子或蛋白酶)控制的生物反应。Antonia等的研究认为，TNF-α介导的细胞凋亡在早期的DR和长期的组织病理学改变中的作用[13]，证实依那西普能减少细胞凋亡及减轻DR。笔者的研究结果与此一致。

高血糖环境下机体细胞代谢发生异常，导致视网膜处于缺血缺氧状态，打破了视网膜血管因子和抑制因子之间的平衡，促使分布于视网膜血管内皮细胞表面的TNF-α增加，破坏视网膜血管内皮细胞之间的紧密连接，导致血-视网膜屏障(blood retinal barrier，BRB)的破坏[14-16]，使血管渗透性增加。另外，TNF-α能增加血管内皮VEGF的表达，VEGF能够干扰视网膜周细胞和毛细血管内皮细胞之间的相互作用，引起新生血管形成及毛细血管通透性增高，导致糖尿病视网膜渗漏增加等一系列病理改变。TNF-α能提高靶细胞对VEGF,TGF-β及IGF-1等因子的反应性，增加VEGF的表达，导致视网膜新生血管生成及血-视网膜屏障破坏。

本研究采用EB渗漏量测定的方法评价各组大鼠视网膜渗漏情况，发现模型组和治疗组的EB渗漏量较对照组明显增高，说明大鼠糖尿病早期视网膜渗漏量增加。治疗组的EB渗漏量较模型组明显减少，说明依那西普能够减轻凋亡及炎症等机制所致的糖尿病视网膜的渗漏，从而减轻糖尿病视网膜的损伤程度。

综上所述，在糖尿病大鼠视网膜中死亡受体Fas，TNF-α及下游的caspase-8的蛋白含量较高，依那西普可以抑制糖尿病大鼠视网膜中Fas，TNF-α及caspase-8的表达，减轻糖尿病大鼠视网膜渗漏量及炎症反应，从而减轻糖尿病大鼠视网膜损伤。