过氧化氢酶单核苷酸多态性与氟斑牙相关性的研究

刘 俊，杨 胜，罗明江，陶 娜，赵 训，张元梅

体内抗氧化酶是机体抗氧化损伤的重要屏障，抗氧化酶基因的多态性可能与该酶的活性及转录活性有关，从而影响个体间对疾病的易感性不同[1]。大量研究表明，抗氧化酶基因的多态性与氧化应激相关疾病，如心血管疾病、癌症、糖尿病和阿尔茨海默病密切相关[2-3]。研究表明，氧化应激在燃煤型氟中毒所致氟斑牙的发生过程中可能起重要作用[4]，而个体对氟的敏感性或耐受性存在差异，提示氟中毒可能存在遗传易感性[5-6]，但有关抗氧化基因多态性与氟中毒的研究较少。过氧化氢酶(catalase，CAT)是一种内源性抗氧化酶，将过氧化氢分解成水和氧气，在控制细胞中的过氧化氢浓度中起主要作用，可以保护细胞免受氧化应激[7]。过氧化氢酶与其他抗氧化酶一起使用，在抗氧化应激的主要防御中发挥着不可或缺的作用。研究报道，编码过氧化氢酶基因的功能多态性将影响酶的活性，导致羟基自由基形成增加和疾病风险增加[8]。因此，本研究旨在通过病例对照研究方法探讨CAT基因单核苷酸多态性与氟斑牙之间的关系，为氟中毒的精确预防提供参考依据。

1 对象与方法

1.1对象 在贵州省氟中毒重病区织金县收集氟斑牙患者195例，男性93例，女性102例，年龄(49.8±12.7)岁(21～78岁)，尿氟(1.87±1.24)mg/L,钙摄入量(507.18±280.90)mg/d。氟斑牙的诊断根据《氟斑牙诊断标准》(WS/T208-2011)，并结合流行病学和临床表现症状，由氟斑牙专家做出诊断。排除各种龋齿及四环素牙等其他牙齿疾病，排除中风、肿瘤、肝硬化等重要疾病及认知或精神异常者。同时收集健康对照组195例，男性80例，女性115例，年龄(46.7±14.4)岁(21～76岁)，尿氟(1.38±1.24)mg/L,钙摄入量(556.96±313.43)mg/d。纳入标准：在招募地居住≥10年，年龄>20岁；排除标准同病例组。本研究经单位伦理委员会批准同意实施。

1.2方法

1.2.1现场调查 由经过专门培训的调查员面对面询问完成，调查内容由4部分组成，即一般人口学资料、生活方式、氟中毒相关情况以及膳食调查。

1.2.2基因组分型 采用EDTA抗凝管收集研究对象的外周静脉血5 mL，-70 ℃保存备用。采用全血基因组DNA提取试剂盒[天根生化科技(北京)有限公司]提取DNA。基因分型采用高通量TaqMan-MGB实时荧光定量聚合酶链式反应技术进行检测，仪器为实时荧光定量PCR仪(Roche Light Cycler480 Software，瑞士罗氏公司)。所有试验由上海生物工程股份有限公司完成。

2 结 果

2.1一般情况 经检验，健康对照组中CAT rs769217和rs2300182两个位点的基因型频率分布符合Hardy-Weinbery平衡定律(P>0.05)。病例组的rs769217和rs2300182位点基因型CC、CT和TT分布频率与对照组比较，差别无统计学意义(P>0.05)。此外，2组间在年龄、民族、文化程度、尿氟水平、烘烤粮食、炉灶改良、使用燃料的类型等方面存在明显差异(P<0.05，表1)。

表1 研究对象的一般情况Tab 1 The characteristics of participants

表中对照组及病例组数据为n(%).

2.2CAT基因不同遗传模式与氟斑牙的关系 将rs769217和rs2300182位点基因型分成共显性、超显性、显性、隐性和累加模式5种不同的遗传模式，单因素分析未发现CAT rs769217及rs2300182位点不同遗传模式与氟斑牙有关，校正性别、年龄、婚姻状况、民族、文化程度、饮酒、吸烟、饮茶、使用燃料种类、改良炉灶、烘烤粮食及钙摄入水平后，仍未发现2个位点与氟斑牙存在关联(表2)。

表2 CAT单核苷酸多态性在病例组与对照组的分布情况及风险估计Tab 2 The distribution of genotype frequency and odds ratio of dental fluorosis CAT SNP

表中对照组及病例组的数据为n(%).a：未校正的OR；b：校正年龄、性别、民族、婚姻状况、文化程度、吸烟、饮酒、饮茶、改良炉灶、使用燃料种类、烘烤粮食及钙摄入水平.

2.3CAT单核苷酸多态性与环境交互作用 将研究对象按性别、吸烟、民族和钙摄入水平进行分层并做交互作用分析，多因素Logistic回归发现，在钙摄入较多时(>482 mg/d)，rs769217位点AT+TT基因携带者相对于AA基因型携带者氟斑牙明显降低，而钙摄入较少时(<482 mg/d)，该保护作用消失。交互作用分析发现，rs769217位点基因多态性与膳食钙的摄入水平存在交互作用(P交互作用<0.05)，OR以及95%CI为0.79(0.63，0.95)，具体见表3～4。

表3 rs2300182位点单核苷酸多态性与环境因素的交互作用分析Tab 3 The interaction between rs2300182 SNP and environment factors

表中对照组及病例组的数据为n(%).a：未校正的OR；b：校正年龄、性别、民族、婚姻状况、文化程度、吸烟、饮酒、饮茶、改良炉灶、使用燃料种类、烘烤粮食及钙摄入水平.

3 讨 论

CAT是一种抗氧化酶，其活性对于防止由活性氧引起的损伤至关重要。人类的CAT基因位于染色体11 p13，全长约37 kb，由12个内含子和13个外显子组成。CAT基因多态性可能与CAT的活性有关，从而影响不同个体对疾病的易感性[8]。Suzen等研究表明，CAT基因多态性引起不同个体的CAT表达差异，导致机体对活性氧的敏感性不同，这可能引起体内羟基自由基增多从而增加疾病风险[9]。氧化应激是燃煤型地方病氟中毒的重要机制，目前关于CAT基因多态性氟中毒的关联研究较少。涂茜等应用聚合酶链反应限制性片段长度多态性分析方法，研究CAT基因启动子区-262C/T、-21A/T多态性与燃煤型氟中毒之间的关联，发现改灶干预组、非干预组和对照组中CAT基因型频率及等位基因频率分布无明显差异[10]。本研究也发现，rs2300182和rs769217两个位点的单核苷酸多态性与氟斑牙风险无明显关联。原因可能是，氟斑牙是一种较复杂的地球化学性疾病，可能是遗传因素与环境因素相互作用的结果，CAT基因与环境因素存在交互作用，导致其效应被掩盖。

本研究探讨年龄、性别、民族、吸烟及钙摄入量等因素与CAT基因两个位点的交互作用，发现膳食钙的摄入水平与CAT rs2300182位点单核苷酸多态性存在交互作用，提示膳食钙在CAT rs2300182位点不同基因型中对氟斑牙的作用有所区别。研究已证明，基因与饮食相互作用可能影响疾病风险[11-13]。Takeshige等研究发现，维生素D受体基因多态性可能与日本患结直肠癌的风险降低是否有关取决于膳食钙的摄入量[11]。Larsen等分析了54个单核苷酸多态性与肥胖相关指标的关系，发现增加钙可降低易肥胖人群的腰围水平[12]。本研究发现，钙摄入水平较高的AT+TT基因携带者发生氟斑牙的风险明显低于AA型携带者。该结果表明，通过补钙预防氟斑牙可能只对AT+TT基因型携带者有用。徐辉等发现，低钙时自由基含量及肾组织细胞内活性氧明显升高，CAT的活性在低钙也明显降低，因此膳食钙及CAT的交互作用可影响氧化应激水平，从而修饰CAT与氟斑牙风险的关联[14]。本研究发现，CAT基因与氟中毒无关联可能被膳食营养等环境因素掩盖。然而，其潜在的生物学机制仍有待阐明。

综上所述，CAT rs769217位点单核苷酸多态性与氟斑牙的风险之间无明显关联，而CAT rs2300182位点单核苷酸多态性与氟斑牙风险降低有关，但取决于钙的摄入量。本研究招募的对象来自乡村居民，均为当地居住10年以上的成年人，但因为年轻男性多外出务工，本研究纳入的多为中老年女性。因此本研究存在一定的选择偏倚。但本研究分层分析未发现CAT rs769217及rs2300182位点与氟斑牙的关系受性别和年龄的影响。本研究结果提示，补钙预防氟斑牙可能只对AT+TT基因型携带者有用，因此通过补钙预防氟中毒需要个体化，为探索地方性氟中毒精准预防及干预提供了理论依据和参考。

表4 rs769217位点单核苷酸多态性与环境的交互作用分析Tab 4 The interaction between rs769217 SNP and environment facors

表中对照组及病例组的数据为n(%).a：未校正的OR；b：校正年龄、性别、民族、婚姻状况、文化程度、吸烟、饮酒、饮茶、改良炉灶、使用燃料种类、烘烤粮食及钙摄入水平.