ω-3多不饱和脂肪酸对对乙酰氨基酚诱导小鼠急性肝损伤的保护作用

陶 涛，周 全，周 嘉

(1.湛江中心人民医院麻醉科，广东 湛江 524045；2.南方医科大学基础医学院免疫学教研室，广东 广州 510515)

对乙酰氨基酚 (acetaminophen，APAP) 是一种广泛使用的解热镇痛药，过量服用会使肝内代谢产物堆积，直接损伤肝细胞，进而导致严重的急性肝损伤，约48%的急性肝损伤由APAP过量摄入引起[1]。研究显示，腺苷酸活化蛋白激酶(adenosine monophosphate activated protein kinase，AMPK)通路激活对保护APAP诱导的肝损伤起关键作用[2-3]。ω-3 多不饱和脂肪酸(ω-3 polyunsaturated fatty acid，ω-3PUFA)是第1个不饱和键出现在碳链甲基端第3位的PUFA，主要包含二十二碳六烯酸(docosahexenoic acid，DHA)和二十碳五烯酸(eicosapentenoic acid，EPA)[4]。研究显示，ω-3PUFA在多个肝脏疾病模型中发挥保护作用，且具有活化AMPK通路的功能[5-7]。本研究使用能够自身合成ω-3PUFA的Fat-1转基因小鼠，探讨 ω-3PUFA 对APAP诱导的急性肝损伤的保护作用及其对AMPK通路的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物无特定病原体级健康C57BL/6雌性野生型(wide type，WT)小鼠24只(WT组)由南方医科大学医学实验动物中心提供，8周龄，体质量22～25(23.47±1.01)g；Fat-1转基因雌性小鼠24只(Fat-1组)由南方医科大学基础医学院周嘉惠赠，8周龄，体质量 20～25(23.13±1.45)g；2组小鼠饲养8周，饲养温度(23±2) ℃，自然通风，明暗周期 12 h/12 h，自由摄食、饮水。

1.2 细胞、试剂与仪器HepaRG细胞(中国科学院上海细胞库)，APAP(美国Santa Cruz公司)，1640细胞培养基、胎牛血清、二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)[赛默飞世尔科技(中国)有限公司]，丙氨酸氨基转移酶(alanine transarninase，ALT)检测试剂盒(南京建成生物工程研究所)，蛋白裂解液和二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)蛋白检测试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)，异硫氰酸荧光素标记的膜联蛋白V/碘化丙啶(annexin V-fluorescein isothiocyanate/propidium iodide，Annexin V-FITC/PI)细胞凋亡检测试剂盒(浙江联科生物技术有限公司)。Western blot和凝胶成像设备(美国Bio-Rad公司)，双激光流式细胞仪(美国BD公司)，组织自动脱水机、恒温摊烤片机、石蜡切片机(德国徕卡公司)，显微镜及其拍照系统(日本Olympus公司)。

1.3 急性肝损伤小鼠模型制备参照文献[8]方法制备急性肝损伤小鼠模型。WT组和Fat-1组小鼠均腹腔注射APAP 400 mg·kg-1；分别于腹腔注射后0、2、6、24 h应用CO2法每组处死6只小鼠，采集小鼠肝组织和静脉血，用于后续实验。

1.4 小鼠血清ALT水平检测应用ALT检测试剂盒检测小鼠血清ALT水平，严格按照试剂盒说明书进行操作。

1.5 苏木精-伊红(hematoxylin-eosin，HE)染色观察小鼠肝组织形态学变化取腹腔注射后24 h处死小鼠的肝组织，40 g·L-1多聚甲醛固定48 h，乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，5 μm切片，通过烤片、脱蜡、水化后，苏木精染色5 min，蒸馏水返蓝 1 min，伊红染色1 min，然后脱水、透明、封片，显微镜下观察并拍照。

1.6 Western blot法检测肝组织中AMPK和磷酸化AMPK(phosphorylated AMPK，p-AMPK)水平称取2组小鼠腹腔注射APAP后0、2、6 h获取的新鲜肝组织100 mg，于蛋白裂解液中充分裂解后离心取上清液，变性制备蛋白样品；将2组样品分别等质量加样至泳道，电泳后转膜至聚偏氟乙烯膜，200 mA 冰浴120 min；50 g·L-1牛血清白蛋白室温封闭60 min后置于水平摇床，加入AMPK、p-AMPK和磷酸甘油醛脱氢酶(reduced glyceraldehyde-phosphate dehydrogenase,GAPDH)一抗，4 ℃孵育过夜；加入二抗孵育 45 min；加入发光液在暗室曝光，经显影、定影后将胶片扫描至电脑，应用ImageJ软件获取条带的吸光度值进行定量分析。

1.7 Western blot法检测HepaRG细胞中AMPK和p-AMPK表达取HepaRG细胞，使用含体积分数10%胎牛血清的1640完全培养基培养，置于 37 ℃、含体积分数5%CO2的饱和湿度恒温细胞培养箱中。应用20 mmol APAP孵育6 h诱导HepaRG细胞凋亡，换培养基后将细胞分为APAP+DHA组和APAP+DMSO组，APAP+DHA组在培养基中加入50 μmol DHA，APAP+DMSO组在培养基中加入DMSO，使其最终体积分数为1‰；继续温箱孵育，分别于处理0、3、6 h时收集大于1×106个HepaRG细胞裂解制备蛋白样品，采用Western blot法检测HepaRG细胞中AMPK和p-AMPK表达，操作步骤同“1.6”项；实验重复3次。

1.8 流式细胞术检测HepaRG细胞凋亡情况取HepaRG细胞并随机分为PBS+DHA组、PBS+DMSO组、APAP+DHA组和APAP+DMSO组，APAP+DHA组和APAP+DMSO组细胞加入20 mmol APAP孵育6 h诱导HepaRG细胞凋亡，PBS+DHA组和PBS+DMSO组细胞加入PBS，换培养基后，APAP+DHA组和PBS+DHA组在培养基中加入50 μmol DHA，APAP+DMSO组和PBS+DMSO组在培养基中加入DMSO，使其最终体积分数为1‰；各组细胞继续温箱孵育6 h，收集细胞，应用Annexin V-FITC/PI凋亡试剂盒检测HepaRG细胞凋亡率，严格按照试剂盒说明书进行操作；实验重复3次。

2 结果

2.1 2组小鼠血清ALT水平比较结果见表1。腹腔注射APAP后0 h时2组小鼠血清ALT水平比较差异无统计学意义(P>0.05)；2组小鼠腹腔注射APAP后2、6、24 h时血清ALT水平显著高于0 h时，差异有统计学意义(P<0.05)；腹腔注射APAP后2、6、24 h时，Fat-1组小鼠血清ALT水平显著低于WT组，差异有统计学意义(P<0.05)。

表1 2组小鼠血清ALT水平比较

nALT/(U·L-1)0 h2 h6 h24 hWT665.86±6.19313.30±26.12a943.00±37.67a424.20±14.64aFat-1671.86±2.53247.40±25.25ab431.80±6.10ab244.80± 12.60ab

注：与0 h时比较aP<0.05；与WT组比较bP<0.05。

2.2 2组小鼠肝组织形态学变化结果见图1。HE染色结果显示，WT组小鼠肝细胞呈现不同程度的变性或坏死，细胞核溶解或固缩，肝细胞索正常形态被破坏并伴有明显的炎性细胞浸润；而Fat-1组小鼠肝脏组织病变较轻。

A：WT组；B：Fat-1组。

图1 2组小鼠肝组织形态学变化(HE染色，×100)

Fig.1 Morphological changes of liver tissues of mice in the two groups(HE staining，×100)

2.3 2组小鼠肝组织中AMPK及p-AMPK相对表达量比较结果见图2和表2。腹腔注射APAP后0 h时2组小鼠肝组织中p-AMPK相对表达量比较差异无统计学意义(P>0.05)；腹腔注射APAP后2、6 h时Fat-1组小鼠肝组织中p-AMPK相对表达量显著高于WT组，差异有统计学意义(P<0.05)。WT组小鼠腹腔注射APAP后2、6 h时肝组织中p-AMPK相对表达量显著低于0 h时，差异有统计学意义(P<0.05)；Fat-1组小鼠腹腔注射APAP后0、2、6 h时肝组织中p-AMPK相对表达量比较差异无统计学意义(P>0.05)。腹腔注射APAP后0、2、6 h时2组小鼠肝组织中AMPK相对表达量比较差异均无统计学意义(P>0.05)。

图2 2组小鼠肝组织中AMPK和p-AMPK表达(Western blot)

Fig.2 Expression of AMPK and p-AMPK in liver tissues of mice in the two groups (Western blot)

表2 2组小鼠肝组织中AMPK及p-AMPK表达比较

nAMPK0 h2 h6 hp-AMPK0 h2 h6 hWT61.20±0.141.14±0.061.14±0.060.76±0.070.38±0.06a0.12±0.04aFat-161.18±0.101.18±0.041.16±0.070.72±0.120.88±0.05b0.80±0.12b

注：与0 h时比较aP<0.05；与WT组比较bP<0.05。

2.4 DHA对APAP诱导的HepaRG细胞中AMPK磷酸化的影响结果见表3和图3。处理 0 h 时2组HepaRG细胞中p-AMPK相对表达量比较差异无统计学意义(P>0.05)；处理3、6 h时，APAP+DHA组HepaRG细胞中p-AMPK相对表达量显著高于APAP+DMSO组，差异有统计学意义(P<0.05)。APAP+DHA组和APAP+DMSO组HepaRG细胞处理3、6 h时p-AMPK相对表达量显著低于0 h时，差异有统计学意义(P<0.05)；APAP+DHA组和APAP+DMSO组HepaRG细胞处理0、3、6 h时AMPK相对表达量比较差异均无统计学意义(P>0.05)。

表3 2组HepaRG细胞中AMPK和p-AMPK表达比较

nAMPK0 h3 h6 hp-AMPK0 h3 h6 hAPAP+DMSO31.94±0.072.03±0.091.96±0.151.05±0.070.31±0.07a0.08±0.03aAPAP+DHA31.97±0.162.06±0.162.03±0.081.02±0.090.56±0.05ab0.27±0.06ab

注：与0 h时比较aP<0.05；与APAP+DMSO组比较bP<0.05。

图3 2组HepaRG细胞中AMPK和p-AMPK表达(Western blot)

Fig.3 Expression of AMPK and p-AMPK in HepaRG cells of the two groups(Western blot)

2.5 DHA对APAP诱导HepaRG细胞凋亡的影响结果见表4。APAP+DMSO组、APAP+DHA组HepaRG细胞凋亡率均显著高于PBS+DMSO组和PBS+DHA组，差异有统计学意义(P<0.05)；APAP+DHA组HepaRG细胞凋亡率显著低于APAP+DMSO组，差异有统计学意义(P<0.05)；PBS+DMSO组与PBS+DHA组HepaRG细胞凋亡率比较差异无统计学意义(P>0.05)。

表4 4组HepaRG细胞凋亡率比较

n/%PBS+DMSO31.91±0.11PBS+DHA31.89±0.08APAP+DMSO36.91±0.11abAPAP+DHA34.03±0.09abc

注：与PBS+DMSO组比较aP<0.05；与PBS+DHA组比较bP<0.05；与APAP+DMSO组比较bP<0.05。

3 讨论

肝脏是药物代谢的主要场所，药物性肝损伤是指由于药物及其代谢产物的毒性损害或过敏反应而产生的肝脏损伤[9]。APAP过量摄入是临床发生药物代谢性肝损伤的主要原因，寻找缓解APAP毒性的方法非常重要。ω-3PUFA是第1个不饱和键出现在碳链甲基端第3位的PUFA，主要包含DHA和EPA。ω-3PUFA具有免疫调节和抗炎的特性，可以通过增加抗氧化酶的能力从而减少过氧化物酶的产生。研究证明，ω-3PUFA在肝硬化、心血管疾病和神经退行性疾病的预防及治疗中具有重要作用[10-12]。Fat-1基因的编码产物是ω-3脂肪酸脱氢酶，其能够使ω-6PUFA脱氢转化为ω-3PUFA，KANG等[13]以C57BL/6小鼠为背景成功建立了Fat-1转基因小鼠，Fat-1转基因小鼠自身能够合成ω-3PUFA。因此，本研究采用Fat-1转基因小鼠和其野生型C57BL/6小鼠作为研究动物，利用Western blot、HE染色和流式细胞术等方法，探究ω-3PUFA对 APAP诱导的急性肝损伤的保护作用及可能机制。

本研究结果显示，小鼠腹腔注射APAP后24 h WT组小鼠肝细胞呈现不同程度的变形或坏死，而Fat-1组小鼠肝脏病变较轻；且2组小鼠腹腔注射APAP后2、6、24 h时血清ALT水平显著高于0 h时，同时Fat-1组小鼠血清ALT水平显著低于WT组；另外，体外细胞研究显示，APAP+DMSO组和APAP+DHA组HepaRG细胞凋亡率显著高于 PBS+DMSO组和PBS+DHA组，APAP+DHA组HepaRG细胞凋亡率显著低于APAP+DMSO组，PBS+DMSO组与PBS+DHA组HepaRG细胞凋亡率比较差异无统计学意义；提示APAP腹腔注射能够诱导小鼠急性肝损伤，而ω-3PUFA能够缓解小鼠由APAP所致的急性肝损伤。

AMPK通路的活化被认为在APAP诱导的急性肝损伤中发挥保护作用，其主要作用机制为稳定肝细胞的线粒体膜电位、促进线粒体融合以维持线粒体功能[14]，抵抗经肝细胞内细胞色素P450家族成员CYP2E1、CYP1A2及CYP3A4代谢APAP产生的代谢产物堆积导致的氧化应激损伤[15]。有研究显示，ω-3PUFA可促进非小细胞肺癌细胞中AMPK磷酸化，从而导致肿瘤细胞凋亡，且AMPK通路的活化可以增强胰岛素抵抗的作用，缓解内质网应激造成的急性损伤[16]。还有研究表明，ω-3PUFA能够减轻LPS所致脑损伤新生大鼠海马组织中的氧化应激反应，减少海马组织细胞凋亡[17]。因此，作者推测ω-3PUFA对APAP造成的肝损伤的保护作用也是通过AMPK信号通路激活而实现的。本研究结果显示，腹腔注射APAP后2、6 h时Fat-1组小鼠肝组织中p-AMPK相对表达量显著高于WT组，WT组小鼠腹腔注射APAP后2、6 h时肝组织中p-AMPK相对表达量显著低于0 h时，而Fat-1组小鼠腹腔注射APAP后0、2、6 h时肝组织中p-AMPK相对表达量比较差异无统计学意义；另外，体外细胞研究显示，处理3、6 h时，APAP+DHA组HepaRG细胞中p-AMPK相对表达量显著高于APAP+DMSO组；提示ω-3PUFA可能通过促进AMPK信号通路活化而保护APAP诱导的急性肝损伤。

综上所述，ω-3PUFA对APAP诱导的急性肝损伤有保护作用，其机制可能与ω-3PUFA促进AMPK通路活化有关。ω-3PUFA的主要成分DHA有可能作为临床营养剂而用于APAP诱导肝损伤的防治。