乳腺癌患者血清及癌组织中骨桥蛋白表达及意义

高金亮，赵 楠，张 浩，李伟汉，陈 琛，郭 满

(1.南阳市中心医院乳腺甲状腺外科，河南 南阳 473000；2.南阳市中心医院营养科，河南 南阳 473000)

乳腺癌是指发生在乳腺上皮组织的恶性肿瘤，是女性最常见的恶性肿瘤之一[1]。乳腺癌早期诊断对于改善患者预后及延长生存期具有重要意义，便捷、快速、准确的肿瘤标志物检测对乳腺癌早期诊断至关重要[2]。骨桥蛋白(osteopontin，OPN)是存在于细胞外基质的磷酸化糖蛋白，近年来研究发现，OPN与多种肿瘤的发生、发展、转移及预后关系密切，是恶性肿瘤生长的血清学指标之一[3-4]。本研究旨在探讨血清OPN水平和乳腺癌组织中OPN表达与乳腺癌患者临床病理特征的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料选择2012年3月至2017年8月南阳市中心医院乳腺甲状腺外科收治的58例乳腺癌患者为研究对象，患者均为女性，符合乳腺癌诊断标准[5]，并经病理学检查确诊，且入院前均未接受放射治疗、化学治疗等。58例乳腺癌患者的年龄33～74(53.14±6.81)岁；肿瘤直径1.3～5.2(2.84±0.66)cm；肿瘤类型：浸润性导管癌31例(Ⅰ级8例，Ⅱ级14例，Ⅲ级9例)，浸润性小叶癌13例，髓样癌8例，其他类型6例。另选择同期收治的83例女性乳腺良性肿瘤患者作为对照，年龄31～76(54.09±7.07)岁；肿瘤直径1.2～6.3(3.03±0.71)cm；肿瘤类型：乳腺纤维腺瘤61例，乳管内乳头状瘤17例，小叶增生5例；所有患者经病理学检查确诊，且在入院前未接受任何治疗。2组患者的年龄比较差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。

1.2 主要试剂与仪器兔抗人OPN多克隆抗体(北京中杉金桥生物技术有限公司)，链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶(streptavidin peroxidase，SP)试剂盒(福州迈新生物技术开发有限公司)，免疫组织化学染色试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)，二氨基联苯胺染色试剂盒(北京博奥森生物技术有限公司)；YD-1508R型切片机(上海之信仪器有限公司)，光学显微镜(日本Olympus公司)。

1.3 酶联免疫吸附试验检测血清OPN水平采集患者清晨空腹肘静脉血5 mL，2 500 r·min-1离心15 min，取上清液，置于-20 ℃冰箱保存待测。采用酶联免疫吸附试验测定血清中OPN水平，试剂盒由美国R&D公司提供，严格按照试剂盒说明书进行操作。

1.4 免疫组织化学SP法检测肿瘤组织中OPN表达取乳腺肿瘤组织标本，体积分数10%甲醛溶液固定，乙醇梯度脱水，二甲苯透明，石蜡常规包埋；石蜡标本连续切片，片厚4 μm；80 ℃烤片2 h，常规脱蜡、水化；磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline，PBS)冲洗3次，每次5 min；采用乙二胺四乙酸 95 ℃ 下抗原修复15 min，充分暴露抗原；滴加体积分数3%H2O2溶液孵育10 min以消除内源性过氧化物酶活性，滴加正常山羊血清封闭 15 min；加入一抗(兔抗人多克隆抗体，PBS稀释比1100)150 mL，4 ℃孵育过夜，PBS冲洗3次，每次 3 min；滴加生物素化二抗工作液，室温下孵育15 min，PBS冲洗3次，每次3 min；滴加SP试剂，室温孵育 15 min，PBS冲洗3次，每次3 min；二氨基联苯胺显色10 min，蒸馏水冲洗10 min，苏木精复染，常规脱水、透明、封片；光学显微镜下观察，拍照。采用已知阳性切片作为阳性对照，采用PBS缓冲液代替一抗为阴性对照。OPN阳性表达判定标准：以肿瘤细胞的细胞质中出现浅黄色、棕黄色或棕褐色颗粒为OPN阳性表达。高倍镜(×400)下随机选择5个视野，每个视野计数200个肿瘤细胞，共计 1 000 个肿瘤细胞，从阳性细胞所占比例及染色强度2个方面分别进行计分。按阳性细胞数占肿瘤细胞总数的比例计分：阳性细胞比例<5%为0分，5%～35%为1分，36%～70%为2分，>70%为3分。按肿瘤细胞染色强度计分：无显色为0分，细胞质内显示浅黄色颗粒为1分，棕黄色颗粒为2分，棕褐色颗粒为3分。以染色强度得分与阳性细胞所占比例得分的乘积作为最终综合得分，>3分定义为阳性，≤3分定义为阴性。

2 结果

2.1 乳腺癌与乳腺良性肿瘤患者血清OPN水平比较乳腺癌和乳腺良性肿瘤患者血清OPN水平分别为(96.47±24.64)、(31.58±6.19)μg·L-1，乳腺癌患者血清OPN水平显著高于乳腺良性肿瘤患者，差异有统计学意义(t=23.008，P<0.05)。

2.2 乳腺癌与乳腺良性肿瘤组织中OPN表达比较结果见图1。乳腺癌和乳腺良性肿瘤患者OPN阳性表达率分别为74.14%(43/58)、19.28%(16/83)，乳腺癌患者OPN阳性表达率显著高于乳腺良性肿瘤患者，差异有统计学意义(χ2=42.226，P<0.05)。

A：乳腺癌组织；B：乳腺良性肿瘤组织。

图1 乳腺癌与乳腺良性肿瘤组织中OPN表达(免疫组织化学，×400)

Fig.1 Expression of OPN in breast cancer and benign breast tumor tissues(immunohistochemistry，×400)

2.3 乳腺癌组织中OPN表达与临床病理特征的关系结果见表1。乳腺癌组织中OPN表达与肿瘤直径、TNM分期、淋巴结转移及组织学分级有关(P<0.05)，与雌激素受体和孕激素受体表达无关(P>0.05)。

表1 乳腺癌组织中OPN表达与临床病理特征的关系

Tab.1 Relationship between OPN expression in cancer tissues and clinicopathological features of breast cancer

nOPN/(%)/(%)χ2P ≥2 cm3832(84.21)6(15.79)5.8310.016 <2 cm2011(55.00)9(45.00)TNM Ⅰ、Ⅱ3319(57.58)14(42.42)6.3550.012 Ⅲ、Ⅳ2522(88.00)3(12.00) N0167(43.75)9(56.25) N11915(78.95)4(21.05)7.8070.020 N22319(82.61)4(17.39) Ⅰ125(41.67)7(58.33) Ⅱ3630(83.33)6(16.67)8.3660.015 Ⅲ108(80.00)2(20.00) 3425(73.53)9(26.47)0.0160.899 2418(75.00)6(25.00) 3124(77.42)7(22.58)0.3740.541 2719(70.37)8(29.63)

2.4 血清OPN水平与乳腺癌临床病理特征的关系结果见表2。血清OPN水平与乳腺癌患者肿瘤直径、TNM分期、淋巴结转移及组织学分级有关(P<0.05)，而与雌激素受体和孕激素受体表达无关(P>0.05)。

表2 乳腺癌患者血清OPN水平与其临床病理特征的关系

nOPN/(μg·L-1)tP ≥2 cm3891.48±23.473.2600.002 <2 cm20119.66±42.58TNM Ⅰ、Ⅱ3391.84±33.412.8890.006 Ⅲ、Ⅳ25123.18±49.17 N01672.48±26.18 N11991.44±31.0711.2800.000 N223125.73±43.89 Ⅰ1283.24±21.55 Ⅱ3695.09±23.483.7810.029 Ⅲ10108.55±26.06 34101.15±23.480.3970.693 24103.66±24.11 31104.07±25.740.3420.734 27106.41±26.33

3 讨论

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，乳腺癌转移和复发是导致患者死亡的主要原因[6]。因此，早期诊断、降低乳腺癌复发和转移是改善患者预后和生存率的关键[7]。

研究显示，肿瘤血管形成在乳腺癌生长、增殖、侵袭及转移过程中发挥至关重要的作用[8]。首先，肿瘤新生血管缺少平滑肌与细胞间的连接，导致其管壁较薄，基膜不完整，肿瘤细胞容易借助新生血管基底膜发生转移[9]；其次，肿瘤新生血管能够为肿瘤细胞的生长、增殖、侵袭提供所必需的氧、营养物质及其他所需物质[10]。OPN是存在于细胞外基质的一种磷酸化糖蛋白，介导骨组织细胞与骨基质的连接，参与骨基质矿化和重吸收过程[11]。在特定的生理和病理条件下，OPN能够与多种整合素受体及CD44进行结合，在促进肿瘤血管形成、肿瘤细胞增殖和侵袭、抑制肿瘤细胞凋亡等多个环节中发挥重要作用[12]。本研究结果显示，乳腺癌患者OPN阳性表达率显著高于乳腺良性肿瘤患者，且乳腺癌患者血清OPN水平显著高于乳腺良性肿瘤患者；乳腺癌患者血清及肿瘤组织中OPN表达与肿瘤直径、TNM分期、淋巴结转移及组织学分级有显著相关性，而与雌激素受体和孕激素受体表达无显著相关性。该结果提示，乳腺癌患者血清及肿瘤组织中OPN呈高表达，OPN高表达可能在乳腺肿瘤细胞的增殖、侵袭、转移过程中发挥作用[13-14]。

综上所述，OPN在乳腺癌患者血清和肿瘤组织中呈高表达，其可能与乳腺癌的发生、发展及转归有关，检测血清中OPN水平可为乳腺癌的早期诊断、预后评估提供参考。