联合运用多种手段证实亲子鉴定案件中D21S11基因座表型1例

姜 磊，徐倩楠，2，朱如心，盛 翔，李 莉

（1.司法鉴定科学研究院 上海市法医学重点实验室 上海市司法鉴定专业技术服务平台，上海200063；2.温州医科大学 法医学系，浙江 温州325035；3.凯杰企业管理（上海）有限公司，上海200003）

1案例

1.1 简要案情

因申报户口需要，孙某某（被检母亲）、张某某（被检父亲）与张某（孩子）来委托本院进行亲子鉴定。

1.2 检验过程

1.2.1 初次检验

按照中华人民共和国公共安全行业标准GA/T383-2014抽提血样DNA，采用GoldenEye 20A DNA身份鉴定系统（北京基点认知公司）进行复合PCR扩增，用3130 XL遗传分析仪（美国Thermo Fisher Scientific公司）进行毛细管电泳和基因型分析。所获得的分型图谱见图1～3。

图1 被检母亲血样分型图谱（20A）

图2 孩子血样分型图谱（20A）

图3 被检父亲血样分型图谱（20A）

1.2.2 初检结果的分析说明

D19S433等19个STR基因座均为人类的遗传学标记，遵循孟德尔遗传定律，联合应用可进行亲权鉴定，其累积非父（母）排除概率大于0.9999。

分型图谱显示，孩子在每个基因座的等位基因均可从被检母亲的基因型中找到来源；除D21S11基因座外，被检父亲均能提供给孩子必需的等位基因。在D21S11基因座（图 4），孩子的表型为“32.2”，被检父亲的表型为“29”，被检父亲不能提供给孩子必需的等位基因“32.2”，不符合孟德尔遗传定律。

图4被检母亲、孩子和被检父亲在D21S11基因座的分型图谱（20A）

1.2.3 第二次检验及结果分析

采用PowerPlex 21系统（美国Promega公司）进行复合PCR扩增，用3130 XL遗传分析仪进行毛细管电泳和基因型分析（五色标记的荧光强度阈值均设定为50RFU）。检验结果显示，相同基因座的分型结果与初检 （GoldenEye 20A DNA身份鉴定系统）相同。但是，在D21S11基因座（图5），被检父亲的“29”等位基因峰之后存在一小峰，孩子在相同位置亦检见一小峰，疑似有等位基因漏检现象。所以，换用其他试剂盒进行核验。

图5 被检母亲、孩子和被检父亲在D21S11基因座的分型图谱（PP21）

1.2.4 第三次检验及结果分析

采用Investigator 24plex QS系统（德国QIAGEN公司）进行复合PCR扩增，用3500 XL遗传分析仪（美国Thermo Fisher Scientific公司）进行毛细管电泳和基因型分析（六色标记的荧光强度阈值均设定为50RFU）。在D21S11基因座（图6），被检母亲的分型为“31，32.2”，孩子的分型为“29.2，32.2”，被检父亲的分型为“29，29.2”。其检验结果支持“1.2.3”中“等位基因漏检”的假设。

图6 被检母亲、孩子和被检父亲在D21S11基因座的分型图谱（Investigator 24plex QS）

1.2.5测序验证

通过UCSC网站查找D21S11基因座核心序列，在STRBase网站查找重复单位，利用Primer 5.0软件设计引物序列，在NCBI网站验证所设计的引物能否扩增出目标片段。

通过以上方法设计D21S11基因座的测序引物，将被检母亲、孩子与被检父亲的DNA样本进行PCR扩增和克隆测序（每个样本都挑选5个以上克隆进行测序），D21S11基因座核心序列为（TAGACAGA）。测序证实，在D21S11基因座，被检母亲的基因型为“31，32.2”，孩子的基因型为“29.2，32.2”，被检父亲的基因型为 “29，29.2”[1]。使用 GoldenEye 20A DNA身份鉴定系统和PowerPlex 21系统分型时，被检孩子和父亲均漏检了等位基因“29.2”，而Investigator 24plex QS系统的检测结果准确无误。

1.2.6 结果与分析

依次选用GoldenEye 20A DNA身份鉴定系统、PowerPlex 21系统和Investigator 24plex QS系统对样本DNA进行PCR扩增，共获得24个STR基因座的基因型（D21S11基因座的基因型经克隆测序确认）。结果表明，孩子的等位基因均可从被检母亲和被检父亲的基因型中找到来源，符合孟德尔遗传规律。经计算，累积亲权指数分别为175760612.513、17536949184.581。

依据亲权鉴定技术规范GB/T 37223-2018，支持被检母亲是孩子的生物学母亲，支持被检父亲是孩子的生物学父亲。

2讨论

2.1 等位基因漏检现象

在亲权鉴定中，当发现被检父母某一方的某个等位基因不能遗传给子女时，除了需要考虑该基因座是否存在突变的可能外，还需注意该基因座是否存在等位基因漏检的现象。此时，可通过更换不同试剂盒进行检验判断，需要时也可进行测序验证，以免得出错误的鉴定意见。

本案中，采用GoldenEye 20A DNA身份鉴定系统对样本DNA进行PCR扩增，检验结果发现被检父亲和孩子仅在D21S11基因座不符合孟德尔遗传规律：孩子的表型为“32.2”，被检父亲的表型为“29”。换用PowerPlex 21系统分型后，判别结果相同，但从分型图谱看来，被检父亲和孩子均存在等位基因漏检的可能。因此选用了第三种试剂盒Investigator 24plex QS系统进行核验，并进一步进行了克隆测序，其结果证实GoldenEye 20A试剂盒、PowerPlex 21试剂盒均在D21S11基因座漏检了被检父亲和孩子的等位基因“29.2”，而 Investigator 24plex QS系统的检测结果完整无误。

2.2 D21S11基因座分型结果的验证

D21S11基因座的核心序列为TAGACAGA，其串联重复区域的序列构成极为复杂，同一等位基因可有多个序列特征，因此，针对测序结果判读等位基因时，应正确运用参考序列进行比对分析，否则容易导致判读错误。例如，本案被检孩子的等位基因“29.2”在串联重复区域的序列构成为TAGATATA GATAGATAGATAGATAGATAGATAGATAGATAGA TATGGATAGATAGATGATAGATAGATAGATATAG ATAGATAGACAGACAGACAGACAGACAGACAGAT AGATAGATAGATAGATAGA，其核心重复单元为TAGA、CAGA，并不呈现为简单的串联重复，各单元之间存在一些间隔序列如 “TA”、“TATGGA”、“TGA”，数算重复次数时该如何取舍，直接关系到等位基因的判读结果是否与毛细管电泳的分型结果一致。本案鉴定中，对等位基因判读时参考了John M.Butler所著《法医DNA分型专论：方法学》附录一中的“报道的STR等位基因大小及序列”，其判读结果与Investigator 24plex QS系统的分型结果相符。