三氟氯氰菊酯分子印迹电化学传感器的制备及其在粮谷快速分析中的应用

赵玲钰 庞 军 高文惠

(河北科技大学生物科学与工程学院，河北省发酵工程技术研究中心，石家庄 050000)

三氟氯氰菊酯(LC)是一种新型的具有广谱、高效、中等毒性和能生物降解的拟除虫菊酯类杀虫剂之一，其结构式如图1所示，广泛应用于粮谷、蔬菜等农作物中。近年来，随着我国农业生产技术的不断发展，促进了农作物的生产与种植量，然而农作物的大量种植给病虫害提供了良好的滋生环境[1]，严重影响了种植业的发展，不合理的施用农药又会产生农药残留问题，对人体健康造成威胁；另外，三氟氯氰菊酯不仅应用广泛，其残留对人体有一定危害，容易出现头昏、呕吐、全身抽搐等症状，严重的还会造成致畸、致癌；因此，对三氟氯氰菊酯农药残留量的测定显得十分重要。我国国家标准规定，谷物中三氟氯氰菊酯的最大残留量为1 mg/kg[2]。目前用于样品中三氟氯氰菊酯的检测方法主要有色谱法[3-6]和色谱-质谱法[7-9]，但色谱法样品前处理复杂、检测成本高、分析周期长，因此建立一种快速、灵敏、准确的检测方法尤为重要。近年来，分子印迹技术与电化学快速检测方法相结合制备的分子印迹电化学传感器已成功地应用于实际样品检测中[10-12]，该类传感器具有灵敏度高、专一性强、制作和检测成本低的优点，现已受到科研工作者的广泛关注。

图1 三氟氯氰菊酯结构式

目前，基于电沉积壳聚糖膜制备三氟氯氰菊酯分子印迹电化学传感器鲜见报道。本研究以三氟氯氰菊酯为模板分子，壳聚糖为功能单体，采用电沉积法制备三氟氯氰菊酯分子印迹电化学传感器，并对印迹传感器的性能进行研究，同时将其应用于粮谷中三氟氯氰菊酯农药残留的快速检测。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

三氟氯氰菊酯(纯度：99%)；壳聚糖(脱乙酰度≥90%)；铁氰化钾、戊二醛、甲醇、冰醋酸、氢氧化钠等均为分析纯。

1.2 仪器与设备

LK98BⅡ电化学分析仪；三电极系统(CHI104玻碳电极(3 mm)、CHI115铂丝电极、CHI111 Ag/AgCl电极)；S22-2型恒温磁力搅拌器；pH211台式酸度计。

1.3 方法

1.3.1 玻碳电极预处理

采用不同粒径(0.5～0.05 μm)的Al2O3粉末作为抛光粉，将玻碳电极置于麂皮上逐级打磨成镜面后置于超纯水和无水乙醇中反复超声清洗1 min，取出电极置于0.5 mol/L的H2SO4溶液中循环扫描，直至获得稳定的循环伏安曲线，待清洗完毕后，将电极置于探针溶液中进行循环扫描，如果得不到准可逆的循环伏安峰(峰电流比为1∶1，峰电位差小于85 mV)，则重新处理电极。

1.3.2 壳聚糖印迹膜的制备

将经过打磨处理的玻碳电极置于2.0×10-4mol/L三氟氯氰菊酯-壳聚糖(LC-CS)电沉积混合溶液中，以-1.5 V的恒电位下电沉积5 min。在负电位条件下电极周围的水分子易被还原而消耗质子，同时在电极表面产生气泡，此时壳聚糖为了补偿水分子还原所消耗的质子而进行去质子化[13]。与此同时，部分与壳聚糖通过氢键等分子间作用力而相互吸引的三氟氯氰菊酯分子一同沉积到工作电极表面，形成一层嵌有三氟氯氰菊酯的分子印迹膜。电沉积后的印迹电极用超纯水冲洗后，置于2.5%的戊二醛(GA)溶液中浸泡10 min，取出印迹电极，于室温下晾干2 h。然后将此印迹电极置于洗脱剂中浸泡洗脱模板分子，再将其置于探针溶液中进行表征，制备三氟氯氰菊酯分子印迹电化学传感器(LC-CS/MIP)。

在相同条件下，采用不含三氟氯氰菊酯模板分子的壳聚糖沉积液中进行电沉积，所制备的电极为非印迹电极(NIP)。

1.4 样品处理

样品：大豆、玉米、糙米(均为市售)。

称取粉碎后样品5.00 g，用20 mL乙腈提取(分2次提取，每次10 mL)，涡旋振荡2 min，超声15 min，4 000 r/min离心10 min，合并2次上清液，用乙腈定容至20mL，待测。

1.5 电化学方法

本研究采用恒电位法沉积壳聚糖印迹膜，沉积电位为-1.5 V；沉积时间为5 min，采用循环伏安法(CV)表征印迹膜的响应特性，表征电位为-0.2～0.8 V，采用差分脉冲伏安法(DPV)对实际样品进行测定，电位增量为4 mV；脉冲幅度为50 mV。

1.6 数据统计

采用Origin8.0对实验数据进行分析以及图形处理。

2 结果与讨论

2.1 三氟氯氰菊酯电化学活性研究

为确定三氟氯氰菊酯是否具有电活性，并考察其对分子印迹电化学传感器的检测是否带来影响，将处理后的玻碳电极置于含有1 mmol/L三氟氯氰菊酯的醋酸钠电解质溶液中循环扫描，循环伏安曲线如图2所示。由图2可知，三氟氯氰菊酯在-0.7 V处有一还原峰出现，但是该峰电流值太低，不足5 μA，难以采用电化学分析法对其直接进行测定，因此需要借助于电活性探针进行间接检测。

结合电化学分析的方法，采用分子印迹技术制备三氟氯氰菊酯分子印迹电化学传感器，借助于电活性探针间接检测粮谷中三氟氯氰菊酯农药残留。

图2 三氟氯氰菊酯在醋酸钠电解质溶液中的循环伏安曲线

2.2 功能单体的选择

制备分子印迹电化学传感器的一个关键环节就是根据待测物质的分子结构和化学性质选择合适的功能单体。壳聚糖(CS)是甲壳素经脱乙酰作用形成的一种含有丰富的-NH2和-OH的高分子化合物，并且经过化学改性后可以得到具有特殊功能的新材料[14]，其结构式如图3所示。

图3 壳聚糖分子结构式

目前，较多学者利用壳聚糖结构中丰富的功能基团与待测物质通过价键结合的方式形成分子印迹复合膜，并将其修饰材料固定在工作电极表面制备成具有高选择性的分子印迹电化学传感器，同时对许多的金属离子、有机物等物质具有良好的螯合、吸附作用也是其一大优势[15]。陈娟娟[16]以壳聚糖为功能单体，选择不同的有机磷农药为模板分子，采用电沉积的方法制备了各种有机磷分子印迹电化学传感器，结果令人满意。因此本研究采用壳聚糖作为功能单体电沉积于电极表面制备印迹聚合物膜。

2.3 电沉积电位的选择

为了初步确定壳聚糖的电沉积电位，实验设置在-1.7～0 V的电位区间进行扫描。结果如图4所示，壳聚糖沉积液的循环伏安曲线在-1.6 V附近出现了一个还原峰，同时在扫描过程中电极周围有气泡出现，表明壳聚糖在沉积过程中物理形态发生了变化，即溶剂水在pH偏酸性的条件下还原成氢气并释放出来，壳聚糖上结合的质子为补充水中质子的缺失而去质子化，并析出附着在电极表面形成壳聚糖沉积层[17]。

图4 工作电极在壳聚糖沉积液中的循环伏安曲线

根据实验现象初步确定了壳聚糖在醋酸钠溶液中的沉积电位为-1.6 V，为得到最优的壳聚糖电沉积电位，实验选择了不同的沉积电位进行电沉积实验，并进行优化。

固定电沉积时间为3 min，研究不同的电沉积电位对传感器响应特性的影响。分别选取在-1.9、-1.7、-1.5、-1.4、-1.2、-1.0 V电位下进行恒电位电沉积实验。实验过程中发现电位越负，电极周围产生气泡的速度越快，同时产生的气泡量增大。将沉积后的电极洗脱模板分子后，于探针溶液中表征时相对峰电流较小；而当沉积电位为-1.5 V时，相对峰电流达到最大，最终确定最佳沉积电位为-1.5 V。电沉积曲线如图5所示，由图5可以看出，在沉积过程中电流响应受到抑制，呈逐步下降趋势，表明沉积膜在形成过程中阻碍了电极表面的电子传递；同时由非印迹电沉积曲线可以看出，模板分子的存在与否对电沉积曲线无明显影响，说明在电沉积的过程中，模板分子的化学结构没有发生改变，对壳聚糖的电沉积实验没有影响。

图5 壳聚糖电沉积曲线

2.4 电沉积时间的选择

电沉积时间的长短直接影响沉积膜的厚度，进而影响分子印迹电化学传感器的响应性能。在最佳电沉积电位-1.5 V条件下，考察了不同的电沉积时间对三氟氯氰菊酯分子印迹电化学传感器性能的影响。分别选取沉积1、2、3、5、7、9、10 min，根据传感器在洗脱模板分子后的相对峰电流值及对模板分子的吸附性能来选择最佳电沉积时间，结果如图6所示。在2 min前，随着沉积时间的增加，峰电流值逐渐下降，表明沉积时间短，洗脱时膜易脱落；沉积2～10 min时，相对峰电流在沉积5 min时最大，并在5 min后相对峰电流呈下降趋势，表明沉积时间小于5 min时，所形成的印迹膜薄，有助于探针离子到达电极表面，洗脱后响应电流值逐渐增大，大于5 min时，形成的印迹膜较厚，直接影响到传感器的灵敏度。因此，最佳电沉积时间为5 min。

图6 不同沉积时间相对峰电流变化值

2.5 洗脱条件的优化

将模板分子从聚合膜中成功洗脱是形成印迹空穴的重要环节，洗脱的基本原理是选择合适的洗脱剂破坏模板分子与功能单体之间的作用力，以达到洗脱模板分子的目的。本实验根据三氟氯氰菊酯的化学性质，选择了冰醋酸-甲醇=1∶5 (V∶V)作为最佳洗脱剂；并对洗脱时间进行了研究，结果如图7所示，浸泡洗脱10 min后响应电流值达到最大。因此，最佳洗脱时间为10 min。

在优化模板分子洗脱条件后，考察了印迹电极对模板分子的吸附时间。将制备好的三氟氯氰菊酯分子印迹电化学传感器置于浓度为0.5 μmol/L的三氟氯氰菊酯标准溶液中吸附不同的时间后，于探针溶液中表征。结果表明，吸附1 min后响应电流值趋于稳定，表明印迹电极上吸附的模板分子量已达到饱和。因此，确定1 min为最佳吸附时间。

图7 洗脱时间优化曲线

2.6 印迹性能表征

采用CV对三氟氯氰菊酯分子印迹电化学传感器的性能进行表征，如图8所示，比较了不同印迹电极于探针溶液中的电化学行为。

注：a为沉积电极；b为沉积电极洗脱后再吸附；c为沉积电极洗脱后；d为裸电极。图8 不同电极在电活性探针溶液中的循环伏安图

沉积电极于探针溶液中扫描时，呈现的响应电流值较小，不足5 μA，表明壳聚糖沉积印迹膜致密，阻碍了探针离子进行电子传递；当洗脱模板分子之后再次扫描时，响应电流值增强，表明洗脱模板分子之后，于电极表面形成了许多印迹空穴，探针离子通过这些空穴到达电极表面进而发生氧化还原反应；将印迹电极再次吸附模板分子之后，响应电流值明显下降，表明模板分子再次占据部分印迹空穴，导致响应电流值减小。曲线的电化学信号明显弱于裸电极，表明在印迹电极表面除带一些特异性能的空穴外，还覆有一层壳聚糖印迹聚合膜。

2.7 选择性及稳定性研究

采用DPV对传感器的重复性和稳定性进行了研究，选取了与三氟氯氰菊酯结构类似的拟除虫菊酯类杀虫剂，如胺菊酯，联苯菊酯进行选择性吸附实验，同时选取了与模板分子结构差异较大的联苯三唑醇、腈菌唑等三唑类农药进行干扰实验。将印迹电极置于探针溶液中，加入浓度为0.7 μmol/L的目标物质进行吸附实验，采用DPV进行表征，结果如图9所示。通过吸附前后响应电流的变化值(ΔI)可以看出，吸附相同浓度的不同物质，印迹电极对模板分子三氟氯氰菊酯的ΔI值最大，但由于联苯菊酯和胺菊酯在结构上与三氟氯氰菊酯相似，并且分子量比三氟氯氰菊酯小，使得联苯菊酯和胺菊酯能够吸附在印迹电极的识别空穴上，从而引起响应电流的变化，但是对三唑类农药的吸附几乎无响应电流变化，说明该传感器可以对三氟氯氰菊酯和其结构类似物进行测定。

将制备的三氟氯氰菊酯分子印迹电化学传感器连续测定20次，所得ΔI的相对标准偏差为3.5%(n=20)，表明该传感器具有良好的重复性，并且传感器的检测性能无衰减现象。

图9 印迹电极的选择性研究

2.8 线性关系和检出限

在最佳实验条件下，配制含有0.02～2.0 μmol/L的三氟氯氰菊酯标准溶液，采用DPV检测，以三氟氯氰菊酯的浓度为横坐标，DPV响应电流变化值(ΔI)为纵坐标绘制标准曲线，不同浓度的DPV曲线如图10所示，随着三氟氯氰菊酯浓度的增大，ΔI值逐渐增大。该传感器在0.1～1.0 μmol/L浓度范围内具有良好的线性关系，检出限为0.04 μmol/L，线性方程为ΔI=10.495c+0.063 9，线性相关系数R=0.993 5。

注：a～f: 0.1、0.2、0.5、0.7、0.9、1.0 μmol/L。图10 不同三氟氯氰菊酯浓度的DPV曲线

2.9 回收率和精密度实验

在最佳实验条件下，取市售大豆、玉米、糙米作为样品，采用三氟氯氰菊酯分子印迹电化学传感器对其进行检测，结果均未检出拟除虫菊酯类农药。在0.1 μmol/L和0.5 μmol/L 2个添加水平下对阴性样品进行样品加标回收率实验，测定结果如表1所示，样品加标平均回收率在81.2%～94.6%之间，相对标准偏差(RSD)在2.1%～4.1%之间(n=5)。结果表明该方法的回收率和精密度良好。

表1 样品的回收率和精密度实验(n=5)

3 结论

本研究以三氟氯氰菊酯为模板分子，壳聚糖为功能单体，采用电沉积法制备三氟氯氰菊酯分子印迹电化学传感器。实验过程中对制备的传感器响应特性进行了研究，选取不同种类的物质考察了传感器的选择性能。结果表明该传感器具有较好的选择性响应，可对三氟氯氰菊酯及其结构类似物进行测定；三氟氯氰菊酯的浓度在0.1～1.0 μmol/L范围内与其相对峰电流呈良好的线性关系，其检出限可达0.04 μmol/L，样品加标平均回收率为81.2%～94.6%，相对标准偏差(RSD)≤4.1%，连续进行吸附洗脱20次之后传感器性能无衰减现象。与传统色谱方法以及色谱-质谱方法相比，该传感器不仅灵敏度高，而且样品处理简单，抗干扰能力强，操作简单，检测快速，可以满足对粮谷中三氟氯氰菊酯残留量的快速检测。