寒葱提取物对肾阳虚大鼠SOD、MDA及睾丸组织的影响

张朝昱， 张 先， 赵 鹏， 李范洙

(延边大学农学院，延吉 吉林 133000)

氧化损伤是指有害刺激对机体作用时，体内增加的自由基打破氧化与抗氧化系统的平衡，氧化水平高出了抗氧化系统的处理能力，从而导致的组织损伤[1-2]。男性的睾丸受氧化损伤时常伴随有肾阳虚症状，动物实验证明，肾阳虚模型小鼠血清中丙二醛( malondialdehyde，MDA) 含量高，超 氧 化 物 歧 化 酶 ( Superoxide dismutase，SOD) 活 性 低[3]，机体抗氧化能力已不足以清除体内多余的活性氧簇(ROS)，进而导致体内的组织细胞发生氧化损伤，甚至凋亡等[4]。目前男性肾阳虚型氧化损伤涉及的一系列复杂生理过程尚未理清，临床治疗不切实际，而通过选择天然保健品的研究开发，进而安全有效防治肾阳虚症状的氧化损伤则是当下的最佳选择。寒葱(AlliumVictorialisL.)学名茖葱，别名旱葱，为百合科多年生草本植物，享有“菜中灵芝”的美誉。和寒葱同属于百合科葱属类的韭菜提取物具有抗肾阳虚症状的氧化损伤作用[5-6]，因此，本试验检测了各实验组大鼠血清中的SOD活性、MDA含量、睾酮(Testosterone，T)含量和生殖器官系数、睾丸组织，旨在探索寒葱提取物对大鼠氧化损伤的修复和肾阳虚症状的改善作用，从而为天然保健食品的开发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

寒葱取自于2017年吉林省延边地区的野生寒葱；SD雄性大鼠，月龄约4个月，体重为(200±20) g，[实验动物生产许可证号：SCXK(辽)2015-0001]，购于辽宁省长生生物技术有限公司，自由饮食饮水。

氢化可的松注射液(河南润弘制药股份有限公司)；SOD -ELISA 试剂盒,MDA -ELISA 试剂盒,睾酮试剂盒,苏木精-伊红(hematoxylin and eosin，HE)染液(南京建成生物工程研究所)。

MultiskanMK3酶标仪(Thermo fisher公司)；Q5000型超微量紫外分光光度计(美国Quawell公司)；CT15RT型台式高速冷冻离心机(上海天美仪器设备工程有限公司)；CUT4062型石蜡切片机(德国SLEE公司)；O-lympusBH-2型光学显微镜(日本Olympus公司)。

1.2 方法

1.2.1 寒葱提取物的制备

1) 水提取物的制备 取寒葱鲜叶1 kg，先用15 L蒸馏水浸泡24 h后回流提取2 h，过滤后再用10 L蒸馏水回流提取1 h，过滤后的滤渣加入5 L蒸馏水回流提取30 min后再次过滤，合并3次所得滤液，利用旋转蒸发仪将滤液浓缩成浸膏，将其放入-80 ℃速冻，再用冷冻干燥机冻干后取出研磨成粉末，置-20 ℃冰箱中保存备用[7-8]。

2) 乙醇提取物的制备 取鲜叶1 kg，先用10 L 80%乙醇浸泡24 h后回流提取2 h，过滤后的滤渣加入10 L 80%乙醇回流提取2 h，过滤后的滤渣加入10 L 80%乙醇回流提取2 h后再次过滤，合并3次滤液，旋转蒸发仪除去乙醇浓缩至浸膏，将寒葱醇提取物放入-80 ℃下速冻，然后用冷冻干燥机冻干后取出研磨成粉末，置-20 ℃冰箱保存。

1.2.2 寒葱提取物的总酚与总黄酮的定量分析

总酚含量测定采用福林试剂法[9]。均匀称取一定质量寒葱粗提物，放入250 mL烧杯中，加入60 mL 80%乙醇匀浆提取，然后过滤得到滤液，把残渣用80%乙醇再提取1次，抽滤合并2次滤液，最后定容到250 mL，即为待测液。

总黄酮含量的测定采用紫外分光光度法[10]。称取2.0 g左右的寒葱粗提物，用石油醚脱脂4 h，再用70%乙醇加热回流2 h，抽滤，所得残渣用70%乙醇进行超声提取30 min，抽滤，合并2次滤液，在旋转蒸发仪中浓缩，70%乙醇清洗定容到50 mL，即为待测液。

1.2.3 大鼠肾阳虚模型的制备与行为观察和给药剂量

在实际的建筑工程施工过程中，一些建筑企业为了自己的经济利益，缩减管理人员编制，导致在工程管理控制过程中，往往是一人身兼数职，管理效果大打折扣，无法有效地控制施工维持在相对安全的条件下，无法监控每一个施工环节保证自身质量。而且一旦某一个环节出现问题，也比较难以追查最终责任负责人。导致公司施工管理以及质量控制工作目标不能实现。

动物试验分寒葱水提物、醇提物2批次进行，每批试验用40只大鼠随机分为5组，每组8只，分为正常组、模型组、低剂量组、中剂量组和高剂量组，除正常组外，其他4组每日上午9点双侧后肢肌注射0.025 g/(kg·d)氢化可的松[11]，正常组每日注射等体积的生理盐水，从给药开始，每3 d观察并记录所有大鼠的体重、毛质变化、排便情况、脱毛状况、体温变化、耳朵颜色变化及活动状态等[12]，连续注射2周。注射1周后，各组开始给予相应处理，每天注射结束1 h之后再进行灌胃，寒葱提取物低、中、高剂量组的灌胃剂量分别为0.4、0.8和1.0 g/(kg·d)，连续灌胃4周。

1.2.4 大鼠生殖器官系数的测定

试验最后1 d对各组大鼠称重后进行乙醚麻醉，固定于木板开腹，心脏快速采血，之后取出大鼠的双侧肾脏、睾丸、附睾、前列腺和精囊，采用精密天平称取各组织湿重并记录[13-14]。生殖器官系数以器官重量除以大鼠体重的百分比表示。

1.2.5 大鼠血清中SOD、MDA和睾酮的测定

大鼠血清中SOD活性、MDA和睾酮含量的测定均严格按照各自试剂盒说明书操作。

1.2.6 睾丸切片染色观察

采用HE染色法，取睾丸组织经10%甲醛固定、脱水、石蜡包埋、切片、HE染色，染色切片在光学显微镜下进行观察和图像分析[11]。

1.2.7 统计学处理

数据采用SPSS 18.0软件处理，结果用均数±标准差(x±s)表示，采用Duncan多重比较法和T检验法对数据进行显著性差异分析，P<0.05。

2 结果与分析

2.1 寒葱提取物中总酚和总黄酮含量

酚类、黄酮类化合物是葱属植物中主要的生物活性物质之一，包括酚酸、槲皮素及一些衍生化合物[15]。由表1可知，寒葱水提物中总酚含量为2.71%，总黄酮含量为9.71 mg/g，均显著高于醇提物中的总酚(1.89%)和总黄酮(6.98 mg/g)含量，说明寒葱水提物和醇提物的化学组分上可能存在差异。葱属植物韭菜的抗氧化活性与其总黄酮和总酚含量存在明显的相关性[5]，可以推测，寒葱水提物和醇提物的抗氧化活性可能存在差异。

表1 寒葱提取物中总酚和总黄酮含量Table 1 Contents of total phenols and flavonoids in the extracts of Allium Victorialis

注：同一行中不同小字母代表组间差异显著(P<0.05)。

2.2 肾阳虚建模行为观察

注射氢化可的松第9天开始，与正常组相比均出现不同程度的食物量下降,饮水量、尿量增多，活动减少、围缩在一起的现象。而随着注射天数增多，逐渐出现体重增长缓慢、体温下降、反应迟钝、弓背畏寒、体毛稀疏失去光泽等阳虚症状。试实验组随着寒葱提取物给予时间的增加，各种状况日趋好转，尿量趋于正常，体毛也逐渐生长，恢复光泽，活动亦增多。

2.3 寒葱提取物对大鼠生殖器官系数的影响

动物生殖器官系数是检测生物体内器官是否损伤或修复的一项重要指标。由表2，3可知，模型组的肾脏、附睾、睾丸和精囊+前列腺系数均比正常组低，且差异显著，说明氢化可的松的注射导致了雄性大鼠生殖器官的损伤，但是经不同剂量的寒葱提取物灌服处理后，其肾脏、附睾、睾丸和精囊+前列腺的生殖器官系数均显著高于模型组，且高剂量组均基本恢复到正常水平，说明寒葱水提物和醇提物对氢化可的松诱导的器官损伤具有显著的修复作用。

表2 寒葱水提物对肾阳虚雄性大鼠生殖器官系数影响(N=8)Table 2 Effect of water extract of Allium Victorialis on the viscera coefficient in male rats (%)

注：同一列中不同小字母代表组间差异显著(P<0.05)，下同。

2.4 寒葱提取物对大鼠血清中MDA含量的影响

细胞膜脂质过氧化的终产物MDA是反映机体受自由基攻击严重程度的重要指标之一。寒葱提取物对大鼠血清中MDA的影响如表4所示。模型组大鼠血清中MDA的含量显著高于正常组，寒葱提取物处理组MDA的含量比模型组低且差异显著；而不同剂量处理组间比较，寒葱水提物低剂量处理组显著高于中剂量和高剂量处理组，醇提物低剂量组则与高剂量组差异显著，寒葱水提物和醇提物高剂量组的MDA含量分别为4.234和3.722 nmol/mL，与正常组水平比较均无显著差异。从而可知寒葱提取物可以降低大鼠血清中的MDA含量，对肾阳虚症状的氧化损伤具有较好的修复作用。

表4 寒葱提取物对肾阳虚雄性大鼠血清中MDA含量的影响(N=8)Table 4 Effect of extract of Allium Victorialis on the MDA content in serum of male rats (nmol/L)

2.5 寒葱提取物对大鼠血清中SOD活性的影响

SOD是一种源于生命体的活性物质，能有效消除生物体在新陈代谢过程中产生的自由基，进而缓解或避免氧化损伤。寒葱提取物对肾阳虚雄性大鼠血清中SOD活性的影响如表5所示。模型组大鼠血清中SOD活性显著低于正常组，而寒葱提取物处理组的SOD活性均比模型组高且差异显著。寒葱水提取物和SOD活性间存在剂量效应，随处理剂量的增加SOD活性也提高，各剂量间存在显著差异；而醇提物低剂量和中剂量处理组间无显著差异，但是均显著低于高剂量组。由此可知，寒葱提取物可提高肾阳虚大鼠血清中SOD活性，使大鼠的抗氧化系统逐步恢复到正常。

表5 寒葱提取物对肾阳虚雄性大鼠血清中SOD活性的影响(N=8)Table 5 Effect of extract of Allium Victorialis on the SOD content in serum of male rats (U/mL)

2.6 寒葱提取物对大鼠睾丸组织的影响

在100倍光学显微镜下观察了经HE染色的各组睾丸组织，正常组的组织排列整齐，生精小管排列整齐，精原细胞及不同发育阶段的精母细胞，精子细胞和精子等清晰可见，各细胞结构层次分明，生精上皮细胞丰富饱满，间质细胞丰富(图1，A)。与正常组相比，模型组组织形状不规整，生精小管排列紊乱，管腔内有部分细胞脱落，生精上皮细胞变薄，精子数量变少(图1，B)。与模型组相比，寒葱提取物处理组的睾丸生精上皮细胞变的丰富，组织排列整齐，生精小管排列整齐，腔内精子数量变多，间质细胞增多，细胞脱落现象减少，其中水提物(图1，C)和醇提物(图1，F)高剂量组则与正常大鼠睾丸微细结构差异不大，基本恢复到正常水平。由此可见，氢化可的松注射诱导的肾阳虚大鼠经服用寒葱提取物后，对睾丸组织损伤的改善效果显著。

注: A-正常组；B-模型组；C-水提高剂量组；D-水提中剂量组；E-水提低剂量组；F-醇提高剂量组；G-醇提中剂量组；H-醇提低剂量组。

图1 寒葱提取物对雄性大鼠睾丸组织的影响(睾丸组织 HE染色 100×)
Fig.1 Effect of extract ofAlliumVictorialison the testicular tissue of male rats

2.7 寒葱提取物对大鼠血清中睾酮含量的影响

生物体内的大部分睾酮是由睾丸组织中的赖迪细胞产生的，它是控制男性生殖器官和男性副性征发育的一种重要激素。由表6可知，模型组与正常组相比睾酮含量显著降低，说明氢化可的松的注射可能导致睾丸组织中赖迪细胞的损伤，使睾酮含量显著降低。但灌服寒葱提取物后，大鼠血清中睾酮含量显著上升，且中剂量组已恢复到正常组水平，高剂量组则高于正常组水平，说明寒葱水提物和醇提物均可提高肾阳虚大鼠血清中睾酮含量。

表6 寒葱提取物对肾阳虚雄性大鼠血清中睾酮含量的影响(N=8)

3 讨论

本试验以野生寒葱为试验材料，以SD雄性大鼠为试验动物，通过设置正常组、模型组、低剂量组、中剂量组、高剂量组来研究寒葱提取物对肾阳虚大鼠血清中的SOD、MDA及睾丸组织的影响。注射氢化可的松14 d后，发现模型大鼠出现食欲减退、消瘦、被毛凌乱无光泽、弓背、反应迟钝、运动迟缓、大便清稀、尿量增多等一系列肾阳虚症状，初步认为雄性大鼠造模成功。给予寒葱提取物28 d后，上述症状与模型组相比明显改善且随寒葱灌胃剂量的增加，改善效果显著。

目前“自由基学说”是细胞损伤的重要机制之一，认为当细胞处于一种氧化失衡的状态，便会发生氧化损伤，甚至凋亡等。睾酮缺乏是男性肾阳虚发生的重要原因[16]，睾酮在睾丸的赖迪细胞中合成，受黄体生成素的调控[17]。当机体处于氧化损伤状态时，赖迪细胞中ROS的积累会使线粒体功能紊乱[18]。同时有研究发现，ROS可能通过抑制Nur77 的转录减少睾酮合成酶基因的表达，导致睾酮合成下降[19]。该试验通过检测发现，肾阳虚雄性大鼠血清的SOD活性下降，MDA 含量上升，睾酮含量下降，表明雄性大鼠体内已发生氧化损伤[20-21]，而在灌胃寒葱提取物后，则显著减少了MDA的堆积并使SOD活性增加，睾酮含量上升，可认为寒葱提取物提高了肾阳虚雄性大鼠机体内的抗氧化能力，进而缓解了大鼠的肾阳虚症状；同时通过观察发现，寒葱提取物处理组与模型组相比，大鼠生殖器官系数显著上升，睾丸生精上皮细胞变得丰富，生精小管排列整齐，腔内精子数量变多，间质细胞增多，说明寒葱提取物可促进肾脏、睾丸、附睾、精囊、前列腺等生殖器官的生长并对睾丸组织的损伤具有很好的修复作用。综上可知，寒葱提取物可能通过维持机体氧化还原系统的平衡来对生殖器官组织细胞的修复起到积极作用，且高剂量组的效果最显著，已接近于正常组水平。寒葱水提物的总酚、总黄酮含量显著高于醇提物，但由于动物试验分2批次进行，无法对2组的MDA、SOD和睾酮数据及肾脏系数、睾丸组织变化进行比较分析，关于寒葱水提物和醇提物对肾阳虚大鼠机体的抗氧化作用以及睾丸组织的影响是否存在差异，如果有差异，是否与寒葱提取物的酚类物质和黄酮类物质有直接关系还需进一步的研究。

4 结论

寒葱提取物使肾阳虚雄性大鼠血清中的氧化损伤因子MDA含量减少，抗损伤因子SOD活性增加，睾酮含量上升，氧化应激系统恢复正常，肾阳虚症状消失；寒葱提取物对肾阳虚大鼠肾脏、睾丸组织的损伤有很好的修复作用；寒葱提取物对肾阳虚雄性大鼠体内的SOD、MDA及睾丸组织的影响存在剂量效应。