一步水热法合成荧光碳点检测锰(Ⅶ)

李俊芬 王冬秀 李鹏霞 董川

摘 要 以苦杏仁酸和脯氨酸为碳源和氮掺杂剂，采用一步水热法合成氮掺杂的蓝色荧光水溶性碳点（CDs），通过透射电镜、红外光谱、X射线光电子能谱、紫外可见吸收光谱和荧光光谱法等手段进行表征。合成的CDs粒径均匀，尺寸约为（2.62 ± 0.20） nm，表面存在氨基、羟基、羧基、CC等官能团。最大激发和发射波长分别为360 和450 nm，具有典型的激发波长依赖性，相对量子产率为7.86%，稳定性好。基于荧光共振能量转移（FRET）原理，CDs的荧光可被Mn有效猝灭。在1～100 μmol/L （即0.055～5.500 mg/L）范围内，Mn 浓度与CDs的荧光猝灭程度呈线性关系，相关系数（R2）为0.9986，检出限为0.04 μmol/L （2.20 μg/L），具有高灵敏度和良好的选择性。此CDs可进入HepG2细胞内，发出蓝光，且胞内荧光强度与Mn浓度大致呈线性关系。将此碳点用于环境水样和细胞内Mn含量的检测，结果良好。

关键词 碳点; 合成; 荧光猝灭; 锰检测

1 引 言

近年来，碳点（CDs）由于其独特的光学性质和潜在的生物医学应用价值引起了广泛关注[1，2]。 与传统的金属量子点（QDs）相比，CDs制备方法简单、材料廉价、对环境友好，具有优异的荧光性能、化学惰性、水溶性、低毒性和生物相容性[3～5]。CDs颗粒表面含有丰富的羧基、羟基、羰基等官能团，易与离子发生作用而导致CDs荧光猝灭。基于CDs的金属离子荧光探针是光学传感器领域的研究热点[6，7]。

锰元素是维持人体健康的主要微量元素，对于组织生长、新陈代谢和抗氧化至关重要。人体所需Mn主要来自食物和水，过量的Mn可引起神经紊乱、DNA突变、极度虚弱，甚至永久性残疾[8]。因此，准确测定环境水、土壤、食物和生物样品中Mn含量很重要[9]。世界卫生组织[10]和我国《生活饮用水卫生标准》（GB5749-85）[11]规定水中Mn的最大允许浓度为0.1 mg/L; 我国《食品营养强化剂使用标准》（GB4880-2012）[12]规定调制乳粉（儿童用乳粉和孕产妇用乳粉除外）Mn使用量为0.3～4.3 mg/kg。目前，測定Mn含量的方法包括原子吸收光谱法[13]、高效液相色谱法[14]、电感耦合等离子体质谱法[15]、溶出伏安法[16]和分光光度法[17]等。这些方法存在一定的局限性，如测定过程复杂、检测范围窄、灵敏度低等。而有关Mn检测的荧光探针方法的报道很少。Gong等[18]报道了一种基于CDs的环境水样和草药中Mn的检测方法。因此，建立简便、灵敏度高、选择性好的Mn荧光检测方法非常必要。

CDs的合成方法有水热合成法、微波辅助法、热分解法、电化学氧化法等。其中，水热合成法具有绿色环保、易于大批量合成的优势，应用最广泛。合成碳点的材料主要分为两类：天然材料（例如牛奶、大蒜、生物质焦油等）和有机分子（如乳糖、柠檬酸、聚乙烯亚胺等）。柠檬酸常作为合成高荧光性能碳点的碳源。如Zhang等[19]以柠檬酸和胺基化合物为原料合成CDs，其荧光量子产率高达99%; Zheng等[20]以柠檬酸和多烯聚胺为原料合成CDs，在CDs表面连接抗癌剂奥沙利铂，用于癌症的靶向治疗。氨基酸因含有丰富的氨基和羧基而常作为合成CDs的氮掺杂剂。苦杏仁酸与柠檬酸同属于果酸，含碳量达63%，具有良好的抗菌效果，本研究将其作为合成荧光CDs的前体，并以含氮量达12%的脯氨酸为氮掺杂剂，通过水热法合成水溶性CDs。合成的CDs具有优异的稳定性，其荧光可选择性地被Mn猝灭，可用于水溶液中和细胞内Mn的检测。

2 实验部分

2.1 仪器与试剂

JEM-2100电子显微镜（日本电子株式会社）; Nicolet iS50红外光谱仪（美国Thermo Corporation公司）; Axis Ultra Dld X射线光电子能谱（XPS，英国Axis Ultradld公司）; F-4500荧光分光光度计（日本日立公司）; UV-265紫外-可见分光光度计（日本岛津公司）; FLS920爱丁堡全功能型稳态瞬态荧光光谱仪（英国Edinburgh Instruments公司）; LSM880 + Airyscan共聚焦激光扫描显微镜（德国Zeiss公司）; pH计（瑞士梅特勒-托利多公司）; ZF-20C暗箱式紫外分析仪（中国宝山顾村电光仪器厂）。

D，L-苦杏仁酸、L-脯氨酸（上海市阿拉丁试剂有限公司）; KMnO4（天津市北辰方正试剂厂）; Dulbecco's modified Eagle's 培养基（DMEM）、胎牛血清（FBS）、二甲基亚砜（DMSO）和3-（4，5-二甲基噻唑-2-基）-2，5-二苯基四唑溴化物（MTT）、青霉素、链霉素（北京索莱宝科技有限公司）。其余试剂均为分析纯。所用金属盐溶液浓度均为0.1 mol/L， 实验用0.01 mol/L磷酸盐缓冲溶液（pH 3～12）采用二次蒸馏水配制。

2.2 CDs的制备

将苦杏仁酸（0.7607 g， 5 mmol）和脯氨酸（0.5757g， 5 mmol）溶于15 mL水中，转移到不锈钢高压釜（20 mL）中，在200℃下水热反应5 h[18]。反应结束后， 自然冷却至室温，将得到的浅黄色溶液过0.22 μm滤膜除去大颗粒，冷冻干燥， 获得CDs粉末。

2.3 荧光量子产率（Yu）测量

以硫酸奎宁（Ys为0.54）为参比物[21]，通过式（1）计算CDs的相对荧光量子产率Yu：

其中， u和s分别为CDs和硫酸奎宁的相关参数，Y为荧光量子产率，F为积分荧光强度，A为入射光吸光度（≈0.05）， η为溶剂的折射率。

2.4 荧光法检测Mn

将CDs配成30.00 mg/mL溶液，于4℃保存。在3.00 mL水中，加入40 μL CDs溶液和一定浓度的KMnO4溶液。使用1 cm石英比色皿，激发和发射狭缝宽均为10 nm，激发波长为360 nm，发射波长为450 nm。

2.5 细胞毒性实验和生物成像

采用MTT方法测定CDs的细胞毒性[22]。将100 μL 5×104 cells/mL的人肝癌组织细胞（HepG2细胞）接种在96孔培养板中。在37℃、 5% CO2恒温培养箱中孵育24 h。除去原培养基，更换为含不同浓度CDs（0、50、100、200、300、400和500 μg/mL）的培养基继续培养24 h。再用含20 μL 5.0 mg/mL MTT的新鲜培养基替换，孵育4 h后， 弃去培养基，并加入100 μL DMSO。振荡15 min后，使用酶标仪在570 nm波长下测量混合物的吸光度。细胞存活率（Survival rate， SR，%）由式（2）计算得到：

其中，A和A0分别是加入和不加入CDs孔的吸光度值。将HepG2细胞在含有青霉素（100单位/mL）、链霉素（100 μg/mL）及FBS（10%）的DMEM培养基中孵育24 h。加入15 μL CDs（培养基中最终浓度为450 μg/mL）孵育1.0 h后，用0.25%胰蛋白酶-0.020% EDTA混合液溶解未贴壁生长的细胞，再用PBS缓冲溶液（pH 7.4）洗涤3次， 每次1 mL。比色皿中保留1 mL PBS缓冲溶液，置于激光共聚焦显微镜下观察细胞形态及CDs的荧光强度。向 PBS缓冲溶液中滴加10.0 mmol/L Mn储备溶液，继续观察细胞形态及荧光强度，激发波长为405 nm，发射波长为460 nm，光谱采集范围为420～500 nm。

3 结果与讨论

3.1 CDs的结构表征

透射电子显微镜（TEM）表征结果如图1A和1B所示，CDs呈准球形，在水溶液中均匀分散，无明显聚集， CDs具有明显晶格条纹，间距为0.21 nm，对应于石墨结构的（002）面[23]; 平均粒径为（2.62 ± 0.20） nm（图1C）。

红外光谱 （图1D） 显示，CDs中存在以下官能团： OH/NH （3058 cm1）、CH（2971 cm1和2863 cm1）、CO（1699 cm1）、CC（1598 cm1） 、NH（1549 cm1）、CNH（1371 cm1）和COH（1264、1067和1016 cm1）[24，25]。CDs的X光电子能谱（XPS）图如图2A所示，在285、 400和531 eV处的3个特征峰分别对应于C1s、N1s和O1s，元素含量比分别为56.36%、12.17%和31.47%。CDs的C1s XPS光谱包含4个峰：284.7 eV（CC）、285.2 eV（CN）、286.5 eV（CO）、288.2 eV（CO）（图2B）[19]。N1s XPS光谱中399.8、401.3和402.0 eV的峰分别对应吡咯氮（CNC）、烷基铵氮（CNH2）和NH基团（图2C）[26，27]。O1s XPS光谱可以分解为4个峰：530.8、531.7、532.4和533.4 eV，分别对应OH、OCO、COH和OCO基团（图2D）[28]。以上结果表明，CDs表面存在氨基、羟基、羧基和CC等官能团。

3.2 CDs的光学性质考察

如图3A插图所示，CDs溶液在365 nm 紫外光激发下发出蓝光。相对量子产率为7.86%。 由图3A可见， CDs在258 nm处有明显吸收峰，归因于芳香族CC双键发生的π-π跃迁，并表明芳香杂环的存在[29]。 CDs的最大激发波长为360 nm，最大发射波长为450 nm。如图3B所示，当激发波长从300 nm增加至400 nm，发射峰从400 nm红移到483 nm， 显示出激发波长依赖性[30]，且荧光强度先增加后降低。这可能是 CDs的尺寸粒径不同或表面发射位点的数量、位置不同所致[18]。

3.3 CDs的荧光稳定性

考察了储存时间、溶液pH值、NaCl浓度对CDs稳定性的影响。在4℃储存60天后，CDs溶液仍澄清透明，荧光强度变化很小。随着溶液pH值升高，CDs在450 nm处荧光强度先逐渐增强后下降，pH=6时，达到最大值。浓度低于2.0 mol/L的NaCl對CDs荧光强度影响不大，表明CDs具有一定的抗盐能力。

3.4 水溶液中基于CDs的Mn检测

3.4.1 Mn检测的选择性 分析了24种离子对CDs荧光强度的影响。如图4A所示，加入MnO4后，体系F/F0值（F0和F分别为未加入离子和加入离子后CDs溶液的荧光强度）明显降低，荧光猝灭效应显著，加入其余离子没有观察到明显的荧光强度变化， 表明CDs对Mn检测具有良好的选择性。

3.4.2 响应时间的影响 在3.00 mL 水中，加入40 μL CDs，固定KMnO4浓度为100 μmol/L。每隔10 s 检测混合溶液的荧光强度。由图4B可见，反应20 s时，Mn对CDs的荧光猝灭程度已经达到恒定，响应时间短。

3.4.3 猝灭机理研究 如图5A所示，Mn在310、350、530和550 nm附近存在4个宽吸收峰。CDs的最大激发波长为360 nm，最大发射波长为450 nm，两者吸收带重叠，符合荧光共振能量转移（FRET）特征[31]。通过双指数函数拟合荧光衰减曲线，如图5B所示。CDs的平均荧光寿命为6.89 ns，存在两种不同寿命组分τ1=3.33 ns（51.33%）和τ2=10.65 ns（48.67%）; 加入Mn后，平均荧光寿命减小为5.64 ns，两种寿命组分分别为τ1=1.81 ns（33.54%）和τ2=7.57 ns（66.46%），表明在荧光猝灭过程中存在电子转移[32]。

3.4.4 基于CDs荧光淬灭检测Mn的分析性能 如图6所示，随Mn浓度的增加，CDs的荧光强度逐渐降低，最大发射波长蓝移。Mn浓度在1～100 μmol/L（即0.055～5.500 mg/L）范围内与CDs的荧光猝灭程度呈线性关系，线性回归方程为1 - F/F0=0.0039CMn+ 0.0039，相关系数（R2）为0.9986， 检出限为0.04 μmol/L（即2.20 μg/L），低于世界卫生组织和我国《生活饮用水卫生标准》规定的限量浓度（0.1 mg/L， 1.82 μmol/L）。

3.4.5 环境水样中Mn的检测 实际样品为山西大学校内自来水（样品1）、鱼塘水（样品2）和令德湖水（样品3），水样隔夜静置，经0.22 μm滤膜过滤后，采用本方法测得各样品中Mn含量依次为0.0 μg/L（0.0 μmol/L）、2.20 μg/L（0.04 μmol/L）和2.87 μg/L（0.05 μmol/L）。在水样中分别加入不同浓度的Mn， 测定加标回收率，结果如表1所示， 回收率为99.6%～109.4%。

3.5 CDs的毒性及其生物成像

采用CDs孵育24 h 的HepG2细胞评估CDs的细胞毒性。如图7D所示，当CDs浓度达到500 μg/mL时，细胞存活率仍接近90%。此外，激光扫描共聚焦显微镜图像（图7A～7C）显示，当用405 nm激光激发时，被CDs染色的HepG2细胞发出蓝色荧光且保持良好的形态， 进一步证明CDs生物相容性好，细胞毒性低。 CDs可能通过内吞作用，透过细胞膜进入细胞质区域[33]。

3.6 细胞中Mn检测

将HepG2细胞与CDs（450 μg/mL）在37℃下孵育1 h后，逐滴加入Mn溶液，Mn浓度依次为0、30、100和200 μmol/L，用激光共聚焦显微镜观察。随着Mn浓度增加，HepG2细胞内荧光强度逐渐减弱，形态保持良好。由图8可见，HepG2细胞内荧光强度与Mn浓度大致呈线性关系。因此，CDs具有定量或半定量检测活细胞内Mn的潜在用途。

4 结 论

采用水热法合成了水溶性CDs。基于对CDs的荧光猝灭效应，实现了环境水样中Mn的定量检测。此方法检出限低、灵敏度高、响应快、选择性好。此外，HepG2细胞的激光共聚焦荧光显微镜成像表明，CDs可以作为生物成像的荧光标记物，用于活细胞中Mn含量的检测。

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