五种植物源提取物对博物馆展厅空气来源细菌的抑制效果

唐 欢，王 春，周理坤，范文奇

(重庆中国三峡博物馆馆藏文物有害生物控制研究中心，重庆 400015)

0 引言

长期以来，有机质文物的霉变现象多有发生，造成文物损毁的情况较为严重。因此，关于文物霉菌污染的来源、种类、防治研究一直是文物保护工作者关注的重点之一［1，2］。但与之相对，微生物另一大类群的细菌对于文物所具有的潜在危害并未得到充分重视。近年来，随着分子微生物学技术的进步与发展，细菌参与文物劣化的报道日益增多。CAPODICASA等［3］运用多种分子生物学手段结合电子显微镜观察，对古代油画表面的微生物进行了深入的分析，并以此揭示了油画表面细菌与真菌的相互关系;L PEZ等［4］利用聚合酶链式反应－变性梯度凝胶电泳(Polymerase chain reaction－Denaturing gradient gel electrophoresis，PCR －DGGE)技术结合克隆文库的构建，研究了油画表面的细菌与真菌微生物群落，发现油画表面来自于空气气溶胶中的细菌都具有典型的磷酸酶—萘酚－AS－BI－磷酸水解酶，这类酶能够参与酯键的水解，进而造成有机质文物成分的降解。同时，意大利学者PI AR等［5］对于巴勒莫地下墓穴墙面、木乃伊内外及其填充物的微生物进行了深入分析，发现大量具有强烈蛋白水解活性及纤维素分解活性的细菌，而这些细菌不仅参与了文物的劣化过程，而且与文物材质的变色直接相关。可见，文物展览和保存环境中的细菌污染问题正逐步凸显。

除了对文物所处环境中细菌与文物的作用过程研究较为缺失外，对于文物展存环境中空气微生物净化措施的研究更是极其有限。随着文物预防性保护理念的深入和相关工作的推广实施，目前对于多种馆藏文物的特征污染物，如甲醛，可使用基于壳聚糖高分子材料制成的高效净化材料进行吸附;甲酸、乙酸，可通过无酸材料的使用逐步进行控制;对展陈环境中的总挥发性有机化合物(Totla volatile organic compound，TVOC)，则可通过包覆铝塑膜封闭处理的方式以降低其对文物的损伤。但对于展厅、展柜内广泛存在的微生物，则缺乏有效手段对其进行净化调控。使用传统的化学药剂(如环氧乙烷、溴甲烷等)熏蒸虽可有效防治馆藏有机质地文物上的有害生物，但其对环境和人体的安全性备受争议。

植物源提取物(Plant－derived extracts)包括从植物中提取的活性成分和按活性结构合成的化合物及衍生物，具有高效环保、通常被认为是安全(General recognized as safe，GRAS)、杀虫灭菌效果显著等特点［6－8］。空气净化上，吴慧清等［9］的研究表明植物精油型空气杀菌剂对空气微生物的清除效果可达到消毒指标要求，林雅慧等［10］利用复合香辛料精油自然挥发可杀灭及抑制空气中大部分细菌;文物保护上，上海博物馆利用蒜素作为文物入库前的消杀熏蒸剂进行文物除菌防霉处理。上述研究结果与实践案例显示植物源提取物作为博物馆内人与文物适用的空气净化剂具有一定可行性。

综上，本研究拟利用活菌计数法和PCR－DGGE技术，评价5种植物源提取物在不同熏蒸剂量下对博物馆展厅内采集到的空气细菌的抑制效果，以期为博物馆文物展陈环境内的空气微生物控制筛选更多安全有效、对人对文物友好的净化剂。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

空气微生物中的细菌培养计数使用营养琼脂平板(重庆庞通医疗器械有限公司)进行培养检测，细菌总菌DNA使用QIAampDNA Mini Kit(QIAGEN)提取;Taq DNA聚合酶为上海生工产品;实验中使用的香叶油、香茅醇、香茅醛、芳樟醇、柠檬醛购自重庆日用化学工业研究所，其中香叶油是混合物，为水蒸气蒸馏精制而得;香茅醇、香茅醛、芳樟醇和柠檬醛全部为合成单体，香茅醇含量是95%，香茅醛的含量为96%，芳樟醇含量为98%，柠檬醛含量为97%。

1.2 主要仪器设备

生化培养箱(SPX－250B型，上海跃进)，PCR仪(C1000型，Bio－Rad)，核酸定量仪(Nano Drop 2000C型，Thermo)，凝胶成像系统(Gel Doc XR+型，Bio－Rad)，变性梯度凝胶电泳仪(DCodeTMUniversal Mutation Detection System，Bio－Rad)，空气浮游菌采样器(ZR2050型，青岛众瑞)。

1.3 实验方法

1．3．1 空气微生物采样 采样时间为2017年5月13日，采样地点为重庆中国三峡博物馆的壮丽三峡展厅，采样方法为撞击法(参照国家标准 GB/T 18883—2002《室内空气质量标准》进行，采样流量为10 L/min，采样时长10 min)。采集后的平板置于手提式冷藏箱内迅速带回实验室。

1．3．2 平板表面熏蒸抑菌实验 用6 mm打孔器在定性滤纸上打出圆形滤纸片，121℃灭菌20 min后烘干备用。带回实验室的平板置于超净工作台上，将圆形滤纸片置于平板盖中心，分别在滤纸上滴加不同剂量的植物源提取物，对照组则滴加对应剂量的无菌生理盐水［4］，每组做3个重复。将处理后的平板用封口膜封口，倒置于生化培养箱中于37℃培养48 h，密封熏蒸。计数后，取各组菌落数最多的一个平板，用无菌去离子水充分冲洗菌落，冻存于－20℃准备进行细菌总DNA提取。

1．3．3 空气微生物总菌DNA提取 细菌总DNA参照试剂盒操作说明进行提取，并由核酸定量仪测定DNA样品浓度和纯度，1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA完整性。

1．3．4 PCR － DGGE 分析［11］5 种植物源提取物平板表面熏蒸后的细菌多样性变化使用16SrRNA基因V3区作为靶标进行PCR－DGGE分析。第一次PCR扩增引物序列为 V3－341f(5’－GTATTACCGCGGCTGTGG－3’)和 V3－GC Clamp－534r(5’－CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGG －CACGG －GGGGACTCCTACGGGAGGCAGCAG －3’)，引物由上海生工公司合成。PCR扩增体系为25 μL，其中模板量10 ng，10 ×Taq 缓冲液(Mg2+plus)2.5 μL，dNTP 1 μL(each 10 mmol/L)，Taq 酶(5 U/μL)0.2 μL，浓度为10 μmol/L 的上、下游引物各 0.5 μL，加无菌双蒸水补至终体积25 μL。PCR循环条件为:94℃预变性4 min;94℃变性45 s，55℃退火45 s，72℃延伸1 min，30个循环后，72℃延伸10 min。

获得PCR产物后，为了去除引物二聚体对DGGE的影响，再按照 XIONG等［12］的方法进行复原条件PCR:取第一次PCR产物5 μL为模板，终体系为25 μL，循环5次，其他条件与第一次PCR的条件相同。

DGGE操作按照DCode System的仪器说明书进行操作，电泳方法参照 MUYZER［13］和 WALTER等［14］的文献，V3区PCR产物的变性梯度设置为35%～65%，聚丙烯酰胺浓度为8%。在200 V电压条件下电泳4 h后，用SYBR greenI染色，凝胶成像系统拍照，图像由Quantity One(Bio－Rad)软件进行分析。

对于需要测序的特殊条带，用无菌刀片将之由DGGE胶上切割下来并用枪头捣碎，以1×Taq缓冲液(Mg2+plus)4℃浸泡过夜，取浸泡液为模板经二次PCR并跑胶，确认与原条带位置相同后，外送上海生工公司测序［15－16］，序列同源性通过在GenBank进行BLAST比对，网址为 www．ncbi．nlm．nih．com。

1．3．5 数据处理 展厅空气来源细菌菌群多样性分析包括丰富度(richness，S)和加权多样性 H'。DGGE图像由Quantity One(Bio－Rad)软件进行分析，该软件自动获取每条泳道内的条带数、条带位置信息及亮度峰值数据，进而进行相似性、多样性分析。S表示DGGE图谱每个垂直泳道内的条带数，H'的计算方法为 H'= －∑PilnPi，其中，Pi=ni/N，代表第i条带的吸光度(ni)与该泳道所有条带吸光度总和(N)的比值［17］。

统计学分析使用SPSS PASW statistics 18.0软件，组间比较使用Oneway ANOVA进行，P＜0.05为统计学上有显著差异，P＜0.01为统计学上极显著差异。

2 结果与讨论

2.1 平板内气相熏蒸前后展厅空气来源微生物数量的比较

表1显示了5种植物源提取物在3个不同熏蒸剂量下对于展厅空气来源细菌数量的抑制结果。首先，活菌计数结果显示展厅内空气微生物总菌落数基本稳定在219～253 CFU/m3的水平中，与前期研究结果相吻合［18］。其次，与对照组相比，5种受试植物源提取物对于空气来源细菌的数量呈现不同程度的抑制。

使用5 μL香叶油进行平板内熏蒸，活菌数与对照组相比无显著性差异(P=0.054＞0.01)，而其他4种植物源提取物在5 μL剂量下均对细菌产生极其显著的抑制。从组间数据比较的统计学结果可见，抑菌效果最好的是柠檬醛，其次是香茅醇和芳樟醇，而效果最弱的是香叶油，略弱是香茅醛。

另外，以柠檬醛为例，在使用熏蒸剂量为5 μL时，平板内生长的菌落总数极显著少于对照组(P=0.003＜0.01)，当熏蒸剂量为20 μL时，熏蒸组的平板中平均只生长了3.33个菌落，柠檬醛对空气来源细菌的抑制作用极其有效(P=0.000＜0.001)，可见其抑菌效果随使用剂量增加而愈发明显。

古希波等［19］利用一种植物消毒剂对空气中白葡萄球菌进行气溶胶喷雾消毒后，活菌计数结果显示其平均杀灭率超过99%，吴慧清等［9］研制的液体复方精油对空气微生物的平均消杀效果也可达到99.93%，以0.1 mL/m3的浓度经加热熏蒸，空气微生物总量从熏蒸前的平均24 954 CFU/m3下降到平均13 CFU/m3。本研究中，使用20 μL香茅醇、芳樟醇、柠檬醛熏蒸后的平均除菌率分别为98.53%，97.95%，98.53%，也具有较好的除菌抑菌效果。

表1 不同剂量植物源对展厅空气来源细菌的数量抑制Table 1 Quantitative inhibition of airborne bacteria in the exhibition hall by different doses of plant－derived compounds(n=3，珋±s)(CFU/m3)

表1 不同剂量植物源对展厅空气来源细菌的数量抑制Table 1 Quantitative inhibition of airborne bacteria in the exhibition hall by different doses of plant－derived compounds(n=3，珋±s)(CFU/m3)

注: 与对照组比较，*P ＜0．05;＊＊P ＜0．01;＊＊＊P ＜0．001。与柠檬醛组相比，△P ＜0．05;△△P ＜0．01;△△△P ＜0．001。

5 μL 10 μL 20 μL对照组 219.33±56．15△△ 253．33±20．82△△△ 227．33±5．03△△△香叶油 174．67 ±70．47△ 65．00 ±35．34＊＊＊△ 19．33 ±14．50＊＊＊△△香茅醇 104．00 ±18．33＊＊ 5．67 ±2．31＊＊＊ 3．33 ±0．58＊＊＊香茅醛 109．33 ±10．07＊＊ 81．33 ±22．03＊＊＊△△ 15．33 ±1．53＊＊＊△芳樟醇 110．67 ±19．73＊＊ 33．67 ±15．50＊＊＊ 4．67 ±1．53＊＊＊柠檬醛 98．67 ±29．48＊＊ 23．00 ±13．11＊＊＊ 3．33 ±1．53＊＊＊

2.2 平板内气相熏蒸前后展厅空气来源细菌多样性的比较

PCR－DGGE本身是建立在不依赖于培养的条件下，可快速、高效、直观研究微生物群落多样性、群落变化动态以及群落微生物组成的分析技术，研究者通过对PCR－DGGE图谱上的特定条带进行回收测序可以快速进行菌种鉴定［20］。本研究利用PCR－DGGE这个特点，在培养平板内，将不同种类植物源提取物在不同熏蒸剂量下对空气来源微生物的抑制能力可视化、直观化，并进一步通过差异条带比较、互补的方法，为下一步的植物提取物复配提供直接证据。

3种剂量植物源于平板内气相熏蒸后，展厅空气来源细菌在PCR－DGGE图谱上，自左至右共16个泳道(lane)，分别显示的是对照组(lane 1)、香叶油(lane 2～4)、香茅醇(lane 5～7)、香茅醛(lane 8～10)、芳樟醇(lane 11～13)和柠檬醛(lane 14～16)。5种植物源以5，10，20 μL的剂量熏蒸处理后，空气中的细菌呈现的种类变化见图1。PCR－DGGE图谱结果表明:不同种类的植物源如同抗生素一样具有不同的抗菌谱，同种植物源不同剂量的熏蒸处理，能够抑制的空气内细菌种类也存在差异。

对PCR－DGGE图谱条带信息进行进一步分析可见，5种植物源提取物熏蒸后细菌PCR－DGGE条带的丰富度和多样性发生变化(表2)。与对照组相比，条带数(丰富度)下降最大的是泳道13，即20 μL芳樟醇熏蒸后，展厅空气来源的细菌的种类下降最多，条带数由15条下降至4条，其次是20 μL香茅醛和柠檬醛熏蒸组，条带数均减少至5条。该结果表明，与香叶油和香茅醇相比，芳樟醇、香茅醛和柠檬醛的熏蒸可以清除更多种类的细菌，即抗菌谱更广。同时，多样性指数降幅最大的是20 μL柠檬醛熏蒸组，H'从对照组的2.31下降到1.18。多样性指数除说明种类数量信息之外，还可反映某种类在整个微生物群落中所占的比例，因此，经20 μL柠檬醛的熏蒸处理后，展厅空气中采集到的细菌其种类和对应数量均降幅最大。

表2 不同剂量植物源熏蒸后展厅空气中细菌丰富度和多样性指数Table 2 Richness and diversity index of airborne bacteria in the exhibition hall fumigated by different doses of plant－derived compounds

通过SPSS的比较分析(图2～3)，与对照组相比，经过10 μL及20 μL植物源提取物熏蒸后，平板中的细菌丰富度极其显著地下降(P=0.004＜0.01，P=0.001 ＜0.01)，但10 μL 植物源提取物熏蒸不会显著降低细菌的多样性指数，仅20 μL组可以起到显著的效果(P=0.011＜0.05)。上述结果说明，使用20 μL的植物源对展厅空气中采集到的细菌进行平板内的气相熏蒸，可以起到显著减少细菌种类及其对应数量的作用。

进一步针对目的条带的测序分析结果见表3。条带8经测序比对与一株瓦式葡萄球菌(Staphylococcus warneri)的相似性为100%，该条带在每个泳道内均存在，说明5种植物源提取物在3个实验剂量下的熏蒸均不能抑制其生长。而条带1，3，4，7也几乎贯穿每个PCR－DGGE泳道，说明通过植物源提取物的熏蒸也较难使其失去活性，通过测序结果可以发现，它们分别是肉葡萄球菌(Staphylococcus carnosus，相似性 100%)、溶血性葡萄球菌(Staphylococcus hominis，相似性100%)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae，相似性100%)、轻型链球菌(Streptococcus mitis，相似性100%)。但香茅醇的熏蒸可以抑制肺炎链球菌(条带4)及轻型链球菌(条带7)的生长，因为在10 μL或20 μL香茅醇熏蒸后，PCR－DGGE图谱泳道内未出现其对应条带。类似地，20 μL芳樟醇或柠檬醛处理可抑制一株肉葡萄球菌(条带1)的生长，但若降低熏蒸剂量至10 μL，则抑制效果消失。条带11代表一株链球菌属(Streptococcus sp．，相似性 100%)，对香叶油处理不敏感，而芳樟醇和柠檬醛的高剂量处理可以有效抑制其生长。

表3 PCR－DGGE条带测序比对结果Table 3 Results of the PCR－DGGE sequencing

此外，柠檬醛熏蒸后，PCR－DGGE胶上反应出来的主要条带数为5条，对这5个条带割胶测序的结果显示，它们分别是条带7(Streptococcus mitis，相似性100%)、条带3(Staphylococcus hominis，相似性100%)、条带 8(Streptococcus pneumoniae，相似性100%)、条带 4(Streptococcus pneumoniae，相似性100%)和条带13(Micrococcus lactis，相似性100%)，该结果表明，20 μL的柠檬醛熏蒸对于这5种细菌没有灭菌作用，但是对于其他种类的细菌，则该剂量的柠檬醛熏蒸处理可以完全抑制其生长。

同时，DGGE图谱对于植物提取物的复配种类与剂量也有直观的指导作用，如本结果中，20 μL的香茅醇与20 μL柠檬醛复配可起到较好的互补作用:柠檬醛无法完全抑制的条带4(Streptococcus pneumoniae)可由香茅醇进行抑制，而香茅醇无法完全抑制的条带1(Staphylococcus carnosus)可由柠檬醛抑制。二者进行复配，可能对这两株菌起到抑制作用。

在空气中细菌的群落组成上，对DGGE图谱上特异条带的测序结果表明，展厅内主要的细菌以多种球菌和杆菌为主，与 GA Z RE 等［21］对卢浮宫、LECH 等［22］对 Krakow 博物馆、武望婷等［23］对首都博物馆展厅空气微生物的研究结果一致。

本研究使用的5种植物提取物中，只有香叶油是混合物，虽然不同产地、不同季节产的香叶油其成分存在一定差异，但主要成分以香茅醇、香叶醇和芳樟醇等为主。我国云南产香叶油香茅醇含量最高，可达40% ～49%［24］。实验结果显示，作为香叶油主要成分的香茅醇、芳樟醇抑菌效果均优于香叶油，一方面，说明二者可能是香叶油的主要抑菌成分;另一方面，说明实验用香叶油中，二者的含量不高。此外，综合对细菌数量和种类的抑制结果，柠檬醛对展厅内空气内的细菌抑制效果最好。柠檬醛对大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、绿脓杆菌的抑菌活性多有报道［25－26］，本研究也显示柠檬醛对一株肉葡萄球菌具有良好的抑制作用，其抑菌机制可能与增高细菌细胞膜的相对渗透率、破坏细菌细胞膜有关［27］。

除了考虑植物源对细菌抑制的有效性外，在其使用过程中对文物的安全性也极其值得关注。通常，文物用熏蒸剂的使用需要充分考虑其对文物本底材质及颜料等的作用［28］，陈元生等［29］研究了中药防霉剂CI、OI和LI对46种霉菌的抑制作用，同时发现在试验期内，3种植物成分对于竹、木、漆、角、纸张和颜料等未产生影响;王克华等［30］的实验表明，香茅醛的熏蒸不会显著改变纸张及颜料的颜色，而柠檬醛和肉桂醛则对纸张及颜料都存在一定程度的影响。可见，不同的植物源对于多种材质的文物本底可能存在不同程度的影响，关于残留的作用尚待开展长期且深入的研究。鉴于植物源对于文物本底的作用尚未明确，本研究仅从预防性保护要求文物保存环境“洁净、稳定”的角度，重点评价了植物源作为展厅空气微生物净化剂的效果，以期通过“洁净”文物展陈的小环境，为展厅内陈列的文物免受微生物危害提供第一层保障。

3 结论

本研究选用5种植物源提取物对博物馆展厅内采集的空气微生物进行了平皿内的气相熏蒸处理，综合对细菌的数量及种类抑制，抑菌效果最好的植物源提取物为柠檬醛，其次为香茅醇、芳樟醇、香茅醛，抑菌效果最弱的为香叶油，同时，PCR－DGGE结果提示，柠檬醛和香茅醇的复配可进一步提高抑菌效果。实验表明，植物源提取物抑菌效果良好，加之其气味芳香温和，易于被公众接受，可作为博物馆展厅内的空气微生物净化剂予以进一步的研究与应用。